JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:06 dk • July 8th, 2025
Bir fare yavrusundan olgunlaşmamış oligodendrositler ve birincil nöronal hücreler dahil olmak üzere bir nöral hücre süspansiyonu alın.
Hücre topaklanmasını önlemek için hücreleri manyetik bir hücre sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
Yüzeylerine anti-O4 antikorları taşıyan tasarlanmış manyetik mikro boncuklar ekleyin. Homojen bir karışım sağlamak için çözeltiyi çalkalayın.
Mikroboncukların, oligodendrositler üzerinde bir O4 antijeni olan sülfatlanmış galaktolipid ile bağlanmasını sağlamak için inkübe edilirken, diğer hücreler bağlanmamış veya gevşek bir şekilde bağlı kalır.
Karışımı ek hücre sıralama tamponu ile yıkayın.
Süpernatanı santrifüjleyin ve atın, ardından hücreleri yeniden askıya alın.
Ardından, boncuk bağlı hücreleri, daha büyük hücre kümelerini ortadan kaldıran bir filtre ile donatılmış manyetik bir ayırma kolonuna geçirin.
Çalışma sırasında, bir manyetik alan altında, boncuk bağlı kompleksler mıknatısa doğru hareket eder ve yanlara yapışır.
Bağlanmamış ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için yıkayın.
Kolonu ayırıcıdan alın ve gelecekteki uygulamalar için birincil oligodendrositleri toplamak için bir proliferasyon ortamı ile yıkayın.
Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti 1 x 107 hücre başına 90 mikrolitre taze manyetik hücre sıralama tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, 1 x 107 hücre başına 10 mikrolitre anti-O4 boncuk ekleyin ve hücre çözeltisini hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. 4 santigrat derecede 15 dakika sonra, hafifçe hafifçe vurarak, her 5 dakikada bir, santrifüjleme ile yıkamak için 1 x 107 hücre başına 2 mililitre manyetik hücre sıralama tamponu ekleyin ve süpernatanı dikkatli bir vakum aspirasyonu ile atın.
Peleti her 1 x 107 hücre için 500 mikrolitre taze manyetik hücre sıralama tamponunda yeniden süspanse edin ve karşılık gelen manyetik ayırıcısına uygun boyutta bir manyetik boncuk sıralama sütunu yerleştirin. Kolonun üzerine 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve süzgeci 3 mililitre manyetik hücre ayırma tamponu ile önceden durulayın, böylece kolonun kurumasına izin vermeden tamponun kolondan geçmesine izin verin. Hücreleri süzgecin içine ekleyin, ardından manyetik hücre sıralama tamponu ile 1 mililitrelik bir yıkama yapın.
Kolonu yıkama başına 3 mililitre manyetik hücre ayırma tamponu ile üç kez ve oligodendrosit proliferasyon ortamı ile bir kez yıkayın. Ardından, kolonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve pistonu 5 mililitre taze oligodendrosit proliferasyon ortamını kolondan hemen boşaltmak için kullanın.