JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:45 dk. • July 8th, 2025
Bir sinir kökü alın ve küçük parçalar halinde doğrayın.
Sindirim enzimi içeren bir tüpe aktarın ve inkübe edin.
Enzim hücre dışı matrisi sindirir.
Sindirimi durdurmak için serum içeren besiyeri ekleyin.
İçeriği tekrar tekrar pipetleyin, ardından süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Peleti yeniden askıya alın.
Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için süspansiyonu bir süzgeçten geçirin. Toplanan hücreleri bir tabakta inkübe edin.
Fibroblast ve Schwann hücreleri veya SC'ler plakaya bağlanır ve bölünür.
Eklenmemiş hücreleri çıkarın. Bağlı hücreleri bir fosfat tamponu ile yıkayın.
Sindirime duyarlı SC'leri gevşetmek için sindirim enzimleri ekleyin. Medya ile sindirimi durdurun.
Ortam ekleyerek SC'leri tamamen ayırın.
Hücreleri bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve SC'ye özgü ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin.
Hücreleri kaplanmamış bir plakaya aktarın ve inkübe edin.
Kalan fibroblastlar yapışacak ve SC'leri süspansiyon halinde bırakacaktır.
Süspansiyonu matris kaplı bir plakaya aktarın.
Schwann hücresinin bağlanması ve bölünmesi için kuluçkaya yatırın.
Sinirleri makasla 3 ila 5 milimetrelik parçalar halinde kesin. 1 mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve sinir parçalarını 5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. 37 santigrat derecede 18 ila 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, sindirimi durdurmak için,% 10 fetal sığır serumu içeren 3 ila 4 mililitre DMEM ekleyin. Karışımı yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. 5 dakika boyunca 800 kez g'de santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve çökeltiyi% 10 FBS ile desteklenmiş 2 ila 3 mililitre DMEM içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 400 gözenekli bir filtreden süzün ve ardından süspansiyonu 60 milimetrelik bir Petri kabını aşılamak için kullanın. Petri kaplarını% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede 4 ila 5 gün inkübe edin.
Kültür% 90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri 1X PBS kullanarak bir kez yıkayın. Daha sonra, Schwann hücrelerini sindirmek için, 60 milimetrelik bir tabak başına 37 santigrat derecede 1 mililitre% 0.25 tripsin ekleyin. Oda sıcaklığında 8 ila 10 saniye sonra,% 10 FBS ile desteklenmiş 3 mililitre DMEM ekleyerek sindirimi durdurun. Schwann hücrelerini ayırmak için, hücrelerin üzerine bir pipetle hafifçe üfleyin.
Hücrelerin ayrıldığını mikroskopla doğrulayın. Daha sonra, Schwann hücrelerini içeren ortamı toplayın ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve çökeltiyi 3 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Kodlanmamış 60 milimetrelik Petri kaplarını aşılamak için süspansiyonu kullanın ve bulaşıkları 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika inkübe edin. Schwann hücrelerini içerecek olan ortamı poli-L-lizin kaplı bir orta kaba aktarın ve kabı 2 gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.