JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:20 dk. • July 8th, 2025
Bir transwell plakasının geçirgen membran ekine bir fare beyni endotel hücresi süspansiyonu ekleyerek başlayın.
Dibe bir büyüme ortamı ekleyin ve inkübe edin.
Ortamdaki büyüme faktörleri ve besinler, hücrelerin tek tabaka olarak büyümesine yardımcı olur.
Ortamı alttan ve ek parçadan çıkarın.
Kalıntıları temizlemek için ekin iç ve dış yüzeylerini yıkayın.
Kesici uca yapışık bir ortam ekleyin ve ek parçayı, birincil kortikal nöral kök ve progenitör hücreleri veya NSPC'leri içeren matris kaplı bir kuyucuğa aktarın ve inkübe edin.
Hem endotel hücrelerine hem de NSPC'lere doğal olmayan bir sialik asit öncüsü analoğu olan azidosugar ekleyin ve inkübe edin.
Endotel hücreleri tarafından salgılanan sitokinler ve kemokinler, NSPC'lerin büyük tabaka benzeri klonlara büyümesini teşvik eder.
Azidosugarlar, NSPC hücre yüzeyindeki sialoglikan yapılarına entegre olur ve glikoproteini etiketler. Bu, genişlemiş NSPC'ler üzerindeki hücre yüzey proteinlerinin tanımlanmasını sağlar.
Endotel hücrelerini hazırlamak için, bir BEND3 hücre peletini 0.10 santimetrelik bir petri kabından 9 mililitre BEND3 hücre ortamı ile% 90 birleşimde yeniden süspanse edin. 1 mililitre hücre süspansiyonunu bir geçirgen destek parçasına ekleyin. Matrisin alt haznesindeki kuyucuk başına 2 mililitre daha BEND3 ortamı ekleyin. Hücreleri bir gün boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile kültürlemeye devam edin.
Hücreleri eklerde kapladıktan bir gün sonra, ortamı önce alt bölmeden ve sonra eklerden nazikçe aspire edin. Eklerin yüzünü önceden ısıtılmış DMEM ile üç kez yıkayın. Eklerin dış yüzeyini önceden ısıtılmış DMEM ile durulayarak yıkayın. Ardından, bir ek parçaya 1 mililitre önceden ısıtılmış ekleyin. Ekleri birincil kortikal hücrelerle kuyucuklara aktarın. Ko-kültürü 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 12 saat inkübe edin.
200 milimolar'lık bir stok konsantrasyonu elde etmek için Ac4ManNAz'yi DMSO'da çözün. Nöral endotelyal ko-kültür plakasını inkübatörden alın. Her bir alt bölmeye 1 mikrolitre Ac4ManNAz stoğu ve ko-kültüre her ek için 0,5 mikrolitre ekleyin. Hücreleri 5 gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Hücreler kültürlenirken, endotel ve nöral hücreleri her gün yeniden beslemek için ek başına 100 mikrolitre RM ve alt bölme başına 200 mikrolitre RM ekleyin.