Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Tohum fare embriyonik kök hücreleri, farklılaşma ortamı içeren düşük bağlantılı bir kapta.

Hücresel agregasyonu ve nöronal bir soya farklılaşmayı kolaylaştırmak için rotasyon altında inkübe edin.

Agregaları bir tüpe aktarın ve yerçekimi ile çökelmelerine izin verin. Medyayı atın.

Agregaları yeniden süspanse edin ve retinoik asit ile desteklenmiş farklılaşma ortamı içeren orijinal tabağa aktarın.

Retinoik asit, nöronal gen ekspresyonunu indükleyerek nöral progenitör hücrelere farklılaşmayı tetikler.

Agregaları bir tüpe aktarın. Ortamı çıkarın ve agregaları ayırmak için tripsin ekleyin.

Tripsini nötralize etmek için bir inhibitör ekleyin.

Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için tekrar tekrar pipetleyin. Agregaları çıkarmak için süspansiyonu filtreleyin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın.

Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için hücreleri polimer kaplı bir tabak üzerine tohumlayın.

Ortamı çıkarın. Nöronal olgunlaşmayı teşvik etmek ve ağa bağlı bir nöron popülasyonu oluşturmak için büyüme faktörleri içeren taze ortam ekleyin.

ESC'lerin nöronlara farklılaşması, rutin bir hücre geçişi sırasında başlar. ESC'leri daha önce olduğu gibi ayırın, ancak nöronal farklılaşma için ek bir plaka ekleyin. 350 mikrolitre hücre süspansiyonunu, 25 mililitre farklılaşma ortamı içeren 10 santimetrelik düşük bağlantılı bir kaba aktarın.

Çanağı, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörü içinde 30 ila 45 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 48 saat inkübe edin. 48 saat sonra, farklılaşan hücre agregalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın.

Hemen ardından, Petri kabına 25 mililitre taze farklılaşma ortamı ekleyin. Agregaların iki ila beş dakika çökmesine izin verin ve bir ila iki milimetre derinliğinde görünür bir pelet üretin. Hala süspansiyonda olan tek hücreleri veya küçük agregaları göz ardı ederek ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini Petri kabına geri aktarmak için bir P1000 pipeti kullanın. Çanağı inkübatördeki döner çalkalayıcıya geri koyun. 48 saat daha sonra, medya değiştirme prosedürünü tekrarlayın. Bu sefer, altı mikromolar all-trans retinoik asit ile desteklenmiş 30 mililitre farklılaşma ortamı ekleyin.

Oluşan pelet şimdi iki ila dört milimetre derinliğinde olacaktır. Hücreleri daha önce olduğu gibi inkübe ettikten sonra, son kez retinoik asit takviyesi ile ortam değiştirme prosedürünü tekrarlayın. Pelet bu noktada dört ila sekiz milimetre derinliğinde olacaktır.

Ertesi gün, kaplama yüzeylerini protokolün yazılı kısmında belirtildiği gibi hazırlayın. Kaplama gününün öğleden sonrasında, önceden alıntılanmış NPC tripsinasyon ortamının her biri 5 mililitre ve% 0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörünü 37 santigrat derecede çözdürün. Ardından, farklılaşan agregaları kültür plakasından 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın.

Agregaların üç ila beş dakika dinlenmesine izin verin ve ardından peleti bozmadan ortamı dikkatlice aspire edin. Daha sonra, peleti 5 ila 10 mililitre PBS ile yıkayın ve agregalar yerleştikten sonra PBS'yi aspire edin ve yıkamayı tekrarlayın. İkinci PBS yıkamasından sonra, peletin üzerine 5 mililitre NPC tripsinizasyon ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin, inkübasyon sırasında tüpü iki ila üç kez hafifçe vurun.

Daha sonra, hücrelere 5 mililitre% 0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve ters çevirerek hızlı bir şekilde karıştırın. Ardından, nispeten homojen bir hücre süspansiyonu üretilene kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle 10 ila 15 kez nazikçe ezin. Hücre süspansiyonunu, 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 40 veya 70 mikronluk bir hücre süzgecinden yavaşça süzün.

Ardından, süspansiyonun tamamı filtrelendikten sonra, kalan hücreleri süzgeçten yıkamak için filtreye 1 mililitre N2 ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 kez g'de altı dakika santrifüjleyin.

Ortamı aspire ettikten sonra, peleti bozmadan, 2 mililitre N2 ortamında tritüre edin, ardından toplam 10 mililitre hacme N2 ortamı ekleyin. 200 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve pelet yıkama işlemini tekrarlayın, peleti 10 mililitre N2 ortamında yeniden süspanse edin.

Hücrelerin bir kısmını çıkarın ve bir hemositometre ile sayın ve ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın. Hücreleri N2 ortamında, mililitre başına 1x çarpı^{10 7} hücrelik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve DIV eksi 1'de hazırlanan tabaklarda santimetre kare başına 150.000 ila 200.000 hücre yoğunluğunda plaka ve 37 santigrat derecede doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. ESN'leri yazılı protokoldeki talimatlara göre koruyun.