JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:19 dk. • July 8th, 2025
Enzimatik olarak sindirilmiş fare siyatik sinir liflerinden bir hücre süspansiyonu ve döküntü alın.
Bir süzgeçten geçirerek kalıntıları temizleyin.
Süzüntüyü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Hücreleri serum içeren ortamda yeniden süspanse edin ve bunları bir yapışma proteini kaplı kültür plakasına tohumlayın.
Hücre yapışması için inkübe edin. Ortamı Schwann hücre ortamıyla değiştirin. Schwann hücresi tek tabaka oluşumu için inkübe edin.
Ortamı çıkarın ve tampon ile yıkayın. Hücreleri ayırmak için tripsin ile inkübe edin.
Enzimatik aktiviteyi durdurmak için serum içeren ortam ekleyin.
Hücreleri toplayın ve santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
Hücreleri tamponda yeniden süspanse edin ve antikor kaplı manyetik mikro boncuklar ekleyin.
Antikorları fibroblast glikoproteinlerine bağlamak için inkübe edin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Hücreleri tamponda yeniden askıya alın ve bunları manyetik ayırıcının manyetik alanına yerleştirilmiş ferromanyetik küreler içeren bir manyetik ayırma kolonuna yükleyin.
Manyetik alan, mikroboncuklara bağlı fibroblastları tutar ve Schwann hücrelerinin akışta toplanmasına izin verir.
Sindirilmiş sinirleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 188 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti% 10 FCS ve mililitre gentamisin başına 50 mikrogram içeren 10 mililitre DMEM içinde yeniden süspanse edin.
Ardından, hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 188 g'da santrifüjledikten sonra, peleti FCS ve gentamisin içeren 4 mililitre DMEM ile yeniden süspanse edin. İki poli-L-lizin ve laminin kaplı 60 milimetre doku kültürü kabının her birine 2 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve plakaları inkübatörde 2 gün boyunca dokunulmadan bırakın.
Schwann hücre süspansiyonunu 188 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve hücre peletini 1 x 107 hücre başına 90 mikrolitre manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, 1 x 107 hücre başına 10 mikrolitre Thy-1 mikro boncuk ekleyin. Yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi karanlıkta 8 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücre süspansiyonuna 2 mililitre manyetik hücre ayırma tamponu ekleyin. 300 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjledikten sonra, peleti 500 mikrolitre manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Manyetik hücre ayırma sütununu hücre ayırıcıya yerleştirin ve sütunu 1 mililitre manyetik hücre ayırma tamponu ile nemlendirin. Ardından, akışı toplamak için hücreleri ona uygulayın.