JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:43 dk • July 8th, 2025
Soğuk bir homojenizasyon tamponunda bir fare beyninden dentat girus alın.
Nöronları, gliaları ve kök hücreleri serbest bırakmak için mekanik olarak ayrışır.
Tamponun hafif deterjanı hücrelere nüfuz ederek çekirdekleri ve diğer organelleri serbest bırakır.
Doku kalıntılarını gidermek için homojenatı filtreleyin. Daha sonra santrifüjleyin, organelleri çıkarın ve sağlam hücreleri parçalamak için homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
Tekrar santrifüjleyin, salınan organelleri içeren süpernatanı çıkarın ve çekirdekleri bir yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
Herhangi bir kalıntıyı, santrifüjü çıkarmak ve süpernatanı çıkarmak için filtreleyin.
Tüm çekirdekleri etiketlemek için bir floresan DNA boyası ve nöron çekirdeklerini etiketleyen nöronal nükleer antijene veya NeuN'ye bağlanan florofor konjuge bir antikor ekleyin.
Floresanla aktive edilen çekirdek sıralamasını kullanarak, tek çekirdekleri ayırarak daha yüksek DNA lekesi floresan yoğunluğuna ve daha yüksek saçılma özelliklerine sahip agregaları tanımlayın.
NeuN pozitif nöronal çekirdekleri ayırarak ve glia ve kök hücrelere ait NeuN negatif çekirdekleri izole ederek tek çekirdekleri analiz edin.
Dokuyu 10 vuruş gevşek A havaneli ve ardından 15 vuruş sıkı B havaneli ile homojenize edin. Homojenatı önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dounce homojenizatörü 1 mililitre soğuk HB ile durulayın ve aynı tüp ile birleştirin.
15 mililitrelik tüpe 3 mililitre HB ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Tüpü hafifçe ters çevirerek bu çekirdek süspansiyonunu iki kez karıştırın. 0,5 mililitre HB kullanarak, 50 mililitrelik bir test tüpünün üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometre süzgeç kapağını önceden ıslatın. Ardından, hücre süzgecini 0,5 mililitre HB ile yıkamadan önce çekirdek süspansiyonunu süzün.
Daha sonra, hücre süzgecini çıkarın ve test tüpünü 500 santigrat derecede 5 dakika boyunca 4 g'da bir döner kova santrifüjünde santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir P1000 pipeti kullanarak peleti 4 mililitre HB içinde nazikçe yeniden süspanse edin.
Buz üzerinde beş dakikalık inkübasyondan sonra, süspansiyonu 500 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 3 mililitre yıkama ortamında tekrar süspanse edin. 35 mikrometrelik bir süzgeç kapağını 50 mililitrelik bir test tüpü üzerinde önceden ıslatmak için 0,5 mililitre yıkama ortamı kullanın. Ardından, P1000 pipet kullanarak bir seferde 0,5 mililitre süspansiyon pipetleyerek çekirdek süspansiyonunu süzün.
Süzgeç kapağını 0,5 mililitre yıkama ortamıyla yıkadıktan sonra tüpü buzun üzerine yerleştirin. Süzüntüyü 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve 500 g'da 5 dakika ve 4 santigrat derece santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 3 mililitre yıkama ortamında yeniden süspanse edin.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve peleti fare anti-Neu ve AlexaFlour488 konjuge antikoru ve mililitre DAPI başına 1 mikrogram ile 1 mililitre yıkama ortamında yeniden süspanse edin. Reaksiyonu karanlıkta buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
Floresanla Aktive Edilmiş Çekirdek Sıralama veya FANS için, immün tipi çekirdek süspansiyonunu 5 mililitrelik bir test tüpüne aktarın ve akış sitometrisi prosedürünün başlangıcına kadar buz üzerine yerleştirin.
Tüpleri FACS cihazına yerleştirmeden önce numuneleri hafif yoğunlukta üç saniye boyunca vorteksleyin.
Leke çekirdeği süspansiyonundan veri elde etmek için, hücre kalıntılarını ve toplanmış çekirdekleri dışlamak için DAPI yüksekliğindeki kapıları ve DAPI alanını ayarlayın. Ardından, tek çekirdekleri kalan DAPI lekeli agrega veya hücre kalıntılarından ayırmak için kütük yan saçılma veya SSC alanındaki kapıları ve kütük ileri saçılma veya FSC alanındaki kapıları ayarlayın.
Ardından, anti-NeuNAF488 ve FSC alanı için kapıları ayarlayarak NeuNAF488 negatif popülasyonu izole edin.
Analizden sonra, anti-NeuNAF488-negatif popülasyonu, geçit stratejisini kullanarak 50 mikrolitre yıkama ortamı ile doldurulmuş 1.5 mililitrelik bir toplama tüpünde sıralayın.