Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Fare Beyni Demiyelinizan Lezyonlarından Mikroglia'nın İzole Edilmesi

Bir fare beyninin korpus kallozumundan lekeli demiyelinizan lezyonları inceleyin.

Bu lezyonlar, hücre yüzeyi integrini CD11b'yi eksprese eden beyinde yerleşik mikroglia içerir.

Dokuyu toplayın ve bir proteolitik enzim ve DNaz içeren bir çözelti ekleyin.

Enzim hücre dışı matrisi bozarken, DNaz serbest DNA'yı bozar.

Soğuk tampon ekleyin ve hücresel kümeleri çıkarmak için süspansiyonu bir süzgeçten süzün.

Santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peletlenmiş hücreleri bir yoğunluk gradyan ortamında yeniden süspanse edin.

Üst katmanlarda kalan kalıntıları toplamak için tampon ve santrifüj ile kaplayın; sağlam hücreler dibe çöker.

Kalıntıları çıkarın ve hücreleri bir tamponda yeniden askıya alın.

Mikroglia'yı etiketlemek için anti-CD11b manyetik boncuklar ekleyin.

Hücreleri, manyetik ayırıcının manyetik alanına yerleştirilmiş ferromanyetik küreler içeren bir sütuna yükleyin.

Dış manyetik alan altında, boncuk bağlı mikroglia, bağlanmamış hücreler akarken kolonda tutulur.

Sütunu manyetik alandan çıkarın. Mikroglia'yı elüte etmek için bir tampon ekleyin.

Korpus kallozum etrafında nötr boya ile işaretlenmiş lezyonları stereomikroskop altında mikrodiseke ederek başlayın. Numuneyi tüpün dibinde toplamak için diseke edilen dokuyu 300 x g'da 30 saniye santrifüjleyin. Enzim karışımı 1'i ve enzim karışımını bir inkübatörde 2 ila 37 santigrat derece arasında önceden ısıtın. Daha sonra, bir numuneye 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 ekleyin ve 37 derece Cantius'ta bir inkübatörde 5 dakika sindirin. 30 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı 2 ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Sindirimden sonra, tüpe 4 mililitre soğuk PBS ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Doku örneklerini 300 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yavaş ve tamamen aspire edin. Hücre peletini 1.550 mikrolitre soğuk PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin. Döküntülerin giderilmesi için 450 mikrolitre soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.

Karışımı 1000 mililitre soğuk PBS ile çok yavaş ve nazik bir şekilde kaplamak için 2 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Santrifüj, karışım ve ardından 3 katmanı arayın. En üst 2 katmanı tamamen aspire etmek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve tüpü 5 mililitreye kadar soğuk yükleme tamponu ile doldurun. Tüpü 3 kez yavaşça ters çevirin.

Daha sonra, süpernatantın santrifüjlenmesi ve aspirasyonundan sonra, hücre peletini 90 mikrolitre yükleme tamponu ile yeniden süspanse edin ve 10 mikrolitre CD11b boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra 1 mililitre yükleme tamponu ekleyin ve sıvıyı 1000 mikrolitrelik bir pipetle yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek hücreleri yıkayın.

Hücreleri 300 x g'da 4:00 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatanı tamamen aspire edin. Hücreleri yükleme tamponunun 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin. Hücreleri korumak için sütunu 500 mikrolitre yükleme tamponu ile durulayın ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlayın.

Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketlenmemiş hücreleri içeren akışı atın. Sütunu yıkamak için 500 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin ve ayırıcıdan çıkarın. Kolonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve kolona 1 mililitre yükleme tamponu ekleyin. Son olarak, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu kolonun altına itin.