JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:59 dk. • July 8th, 2025
Genetiği değiştirilmiş bakterileri bir nematod büyüme ortamında ele alalım.
Bakteriler, nematod kromatin düzenleyici faktör genine sahip bir plazmit taşır.
Ortam, kromatin düzenleyici faktör genini bir dsRNA'ya kopyalayan bakteri genomundan bir transgenik RNA polimerazın ekspresyonunu tetikleyen bir indükleyici içerir.
Bir ısı şoku promotörü altında nöron kaderini indükleyen bir transkripsiyon faktörü geni taşıyan transgenik nematod larvalarını ekleyin.
Bakteri tüketimi üzerine, yutulan dsRNA, kromatin düzenleyici faktör ekspresyonunu aşağı regüle eden ve hücre kaderinin yeniden programlanmasını kolaylaştıran siRNA üretir.
Ebeveynlerin germ hücreleri aracılığıyla, siRNA döllere geçer.
Çıkıntılı bir vulva fenotipi ile gösterilen döl germ hücrelerindeki kromatin düzenleyici faktör ekspresyonunun aşağı regülasyonu, bunların yeniden programlanmasına izin verir.
Döllere ısı şoku uygulayın, ısı şoku promotörü aktive edin ve nöronal farklılaşmayı tetikleyen, germ hücrelerini nöronlara dönüştüren nöron kaderini indükleyen transkripsiyon faktörünü ifade edin.
Nöronlar, mikroskobik görselleştirmeyi kolaylaştıran transgenik bir floresan raportör proteini eksprese eder.
Replika başına 50 L4 solucanını bir NGM RNAi plakasına manuel olarak aktarın. Platin tel kullanın. L4 solucanları, ventral taraflarının yaklaşık yarısında beyaz bir yama ile tanınabilir. Şimdi, solucanları karanlıkta yaklaşık yedi gün boyunca 15 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. IPTG ışığa duyarlıdır.
F1 dölleri L3 ve L4 aşamalarına ulaştığında, onları daha büyük, daha kalın ebeveyn hayvanlardan ayırın. Bu noktada, lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olduğunu gösteren çıkıntılı vulva fenotipi için F1'i tarayın. RNAi aktivitesi ayrıca 15 santigrat derecenin üzerine çıkan ölümcüllüğe neden olabilir. G1'i aktive etmek ve F1 soyunda germ hücresinin nörona dönüşümünü indüklemek için, solucanları karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca ısı şoku uygulayın. Daha verimli bir ısı şokuna izin verdiği için havalandırmalı bir inkübatör kullanın.
Isı şokundan sonra, plakaları gece boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin. Hayvanlar orta L3 aşamasına ulaşmadan önce ısı şoku ile Q1'in aşırı ekspresyonunu indüklemekten kaçınmak önemlidir. Bu, hedeflenmemiş dokularda Q1 proteininin ekspresyonuna yol açabilir. Ertesi gün, hayvanları orta vücut bölgesinde transgen kaynaklı floresan açısından incelemek için bir floresan ışık kaynağı ve GFP filtresi kurun.