Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Bir farenin beyninin sırt tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın.

Mikroskop altında, serebral hemisferleri ayırın. Lateral ventrikülleri ve üçüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için korteksi ve ardından hipokampusu çekin.

İki lateral koroid pleksusları toplayın. Bunlar, yan ventrikülleri uzun bir örtü gibi kaplayan bağışıklık hücresi açısından zengin beyin yapılarıdır.

Granüler bir yüzeye sahip kısa bir yapı olan üçüncü ventrikül koroid pleksusunu toplayın.

Dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği ayırın.

Granüler bir yüzeye sahip uzun küresel bir yapı olan dördüncü ventrikül koroid pleksusunu toplayın.

Doku bütünlüğünü korumak için tüm koroid pleksusları tamponlu salin içeren bir tüpe yerleştirin.

Bir sindirim enzimi çözeltisi ekleyin ve çalkalama ile inkübe edin.

Enzim hücre dışı matrisi parçalar ve hücreleri gevşetir.

Enzimi etkisiz hale getirmek için uygun bir tampon ekleyin.

Hücreleri yerleştirmek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve daha fazla analiz için hücreleri yeni bir tamponda yeniden süspanse edin.

Başlamak için, bir C57 siyah 6 fare sırt tarafından kesilen beyni bir Petri kabına yerleştirin ve çanağı dürbün luplarının hedeflerinin altına yerleştirin. Beyni forseps kullanarak yerinde tutarken, başka bir forseps çiftinin iki ucunu hemisferler arasındaki orta hattan aşağı doğru sokun.

Forsepsleri kullanarak, kallozum ve hipokampus ile korteksi septumdan uzağa çekin, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarın. Lateral koroid pleksusu, lateral ventrikülü kaplayan ve her iki ucunda genişleyen uzun bir örtü olarak tanımlayın. Daha sonra, ince forsepsin iki ucunu kullanarak, lateral koroid pleksusu toplayın. Hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenen üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin.

Daha sonra, tüm üçüncü ventrikülü ve karşı lateral ventrikülü ortaya çıkarmak için korpus kallozum ve kontralateral hemisferin hipokampusu ile korteksi septumdan uzağa çekin. İnce forseps kullanarak, granüler bir yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanan üçüncü koroid pleksusu toplayın. Ardından, diğer lateral koroid pleksusu toplayın.

Daha sonra, forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına yerleştirin ve dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın. Daha sonra, dördüncü koroid pleksusu, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan serebellum ve medulla arasındaki sol uca kadar kaplayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun, küresel bir yapı olarak tanımlayın. İnce forseps kullanarak dördüncü koroid pleksusu toplayın.

Toplanan tüm koroid pleksusları kollajenaz IV ile inkübe ettikten sonra, ayrışmayı sonlandırmak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için tüpü MACS tamponu ile 1,5 mililitreye kadar doldurun. Daha sonra, hücreleri santrifüjleyin ve hücreleri 1.5 mililitre MACS tamponu ile yıkamadan önce süpernatanı atın. Uygun kompanzasyon boncuklarını ve antikor çözeltilerini ekledikten sonra, numuneleri ışığa maruz kalmaktan koruyarak 30 ila 45 dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, tüpleri 1,5 mililitre MACS tamponu ile doldurun.