Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Yenidoğan bir fare beyni ile başlayın ve onu proteolitik bir enzim çözeltisi içeren bir tüpe aktarın.

Enzimler dokunun hücre dışı matrisini bozar ve hücre ayrışmasını başlatır.

Enzimleri uzaklaştırmak için sindirilmiş dokuyu bir büyüme ortamı ile tekrar tekrar yıkayın.

Dokuyu daha küçük parçalara ayırmak için pipet boyunca tekrar tekrar hareket ettirmek için daha büyük çaplı bir pipet kullanın.

Ardından, daha küçük çaplı bir pipet kullanarak, bir hücre süspansiyonu oluşturarak parçaları ayırmaya devam edin.

Hücre kümelerini çıkarmak için bu süspansiyonu filtreleyin ve birincil nöronlar ve mikroglia ve astrositler dahil olmak üzere karışık bir glial hücre popülasyonu içeren tek hücreli bir süspansiyon elde edin.

Hücreleri, bir büyüme ortamı içeren bir kültür şişesine tohumlayın ve yapışmalarını teşvik etmek için inkübe edin.

Zamanla, ortamda nöron büyüme faktörlerinin yokluğu nöronal ölüme neden olur.

Harcanan medyayı yeni medyayla değiştirin. Glial hücreler besinleri kullanır ve çoğalır, karışık bir glial astrosit ve mikroglia kültürü oluşturur.

Beyni 2 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Beyni, ortamı ekleyip çıkararak taze büyüme ortamı ile yıkayın. Yıkamaların tamamlanmasından sonra, beyin başına 2 mililitre büyüme ortamı ekleyin ve beyni ezerek homojenize edin.

Beyin dokusu küçülmediğinde, daha küçük bir diyafram açıklığına sahip bir pipete geçin. Titrasyonun sonunda, süspansiyon görünür parçalar olmadan berrak olduğunda, tek hücreli bir kültür oluşturmak için süspansiyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.

Daha sonra, 8 ila 9 milimetre büyüme ortamını beyin başına iki şişe olacak şekilde T75 şişelerine pipetleyin ve her şişeye 1 mililitre beyin homojenatı ekleyin. 16. günde izolasyona kadar hücreleri büyütün.