JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 5:09 dk. • July 8th, 2025
Müller Glial veya MG hücreleri ve nöronları içeren fare retinalarını ele alalım.
Bunları sindirim enzimleri ile bir ayrışma çözeltisine koyun ve eşit enzim dağılımını sağlamak için hafif sallanma ile inkübe edin.
Bu enzimler, hücre dışı matrisi parçalayarak tek tek hücreleri ayırır.
Hücreleri serbest bırakmak için retinaları birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Enzim aktivitesini durdurmak için bir inhibitör ekleyin, ardından santrifüjleyin.
Süpernatanı atın.
MG hücrelerine özgü bir büyüme faktörü içeren ortamlarda hücreleri yeniden süspanse edin.
Hücreleri bir kuyuya aktarın ve inkübe edin.
Zamanla, ortamdaki büyüme faktörü MG hücrelerinin büyümesini ve çoğalmasını kolaylaştırırken, bölünmeyen nöronal hücreler yok olur.
Ortamı çıkarın. Bir tuz tamponu ile yıkayın.
Hücreleri kuyudan ayırmak için bir sindirim enzimi ile inkübe edin.
Hücreleri bir tüpte toplayın ve ardından santrifüjleyin.
Ölü nöronal hücreleri içeren süpernatanı atın.
Daha fazla analiz için MG hücrelerini ortamdaki yeniden askıya alın.
El yazmasında anlatıldığı gibi papain DNaz I ayrışma karışımını hazırlayın. Şimdi, büyütülmüş uçlu bir transfer pipeti ile retinaları alın. Retinalar ucun dibine yerleşene kadar bekleyin ve retinaları aşırı HBSS olmadan papain DNaz I karışımı içeren tüpe bırakın.
Daha sonra, tüpü inkübatördeki bir nutatörün üzerine yerleştirin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksit ile 10 dakika inkübe edin. Ardından, 1 mililitrelik bir pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra, papain'i nötralize etmek için papain ayrışma kitinden 275 mikrolitre ovomokoid proteaz inhibitörü ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
Tüpleri bir santrifüje yerleştirin ve 300 nispi merkezkaç kuvvetinde 8 dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürün. 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine epidermal büyüme faktörü ekleyin. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.
Tüpün altındaki pelete dokunmadan, süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Şimdi, hücre peletini 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu etiketli 12 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Tüpü 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile durulayın ve kuyuya ekleyin.
Kuyu plakasını dikkatlice sallayın. Ardından, plakayı karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. %90 ila %100 hücre birleşmesini kontrol ederek başlayın. Daha sonra, ortamı çıkarın ve kuyuyu yıkamak için 1 mililitre soğuk HBSS ekleyin. Plakayı nazikçe sallayın ve HBSS'yi herhangi bir iz bırakmadan çıkarın.
Daha sonra, hücreleri kuyudan ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözeltiden 500 mikrolitre ekleyin. Yavaşça sallayın ve 37 santigrat derece inkübatörde 2 dakika inkübe edin. Plakayı inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıdıktan sonra, eğme sırasında tripsin içeren solüsyonu aspire edin. Hücreler tamamen ayrılana kadar dikkatlice ve yavaşça kuyu üzerine birkaç kez dağıtın.
Daha sonra, bu hücre süspansiyonunu steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri santrifüje koyun. 4 santigrat derecede 8 dakika boyunca 300 kez g döndürün ve tüpleri biyogüvenlik kabinine geri getirin. Pelete dokunmadan süpernatanı çıkarın. Şimdi, 600 mikrolitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek ve yaklaşık 30 ila 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin.