Floresanla Aktive Edilen Çekirdek Sıralaması Kullanılarak Beyin Dokusundan Hücre Popülasyonlarının İzole Edilmesi

Bir parça taze donmuş insan beyni dokusunu soğuk lizis tamponu içeren uygun bir öğütücüye aktarın.

Dokuyu mekanik olarak kırmak ve hücreleri serbest bırakmak için havaneli yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Lizis tamponundaki deterjan molekülleri hücre zarını kırarak çekirdeği serbest bırakır.

İçeriği uygun bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpün dibine soğuk sükroz tamponu ekleyerek bir yoğunluk gradyanı oluşturun.

Tüpün altındaki çekirdekleri ayırmak için yüksek hızda santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve çekirdekleri tamponlu bir tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Çekirdeğe hedefe özgü florofor konjuge antikorlar ekleyin ve antikorun hedef nükleer proteinine bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.

Bozulmamış DNA'yı görselleştirmek için nükleer boyama boyası ekleyin.

Farklı floresan sinyallerine dayalı olarak farklı hücre popülasyonlarının çekirdeklerini sıralamak için floresanla aktive edilen çekirdek sıralaması gerçekleştirin.

Taze, donmuş bir insan yetişkin korteks doku örneğinden yaklaşık 200 ila 400 miligram dokuyu incelemeye başlayın. Dokuyu buz üzerinde 4 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu içeren 7 mililitrelik bir cam doku Douncer'a yerleştirin ve dokuyu yaklaşık 50 kez öğütün.

Homojenatı 12 mililitrelik bir ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın. Sükroz ve doku homojenatı arasındaki arayüzü bozmadan ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mililitre buz gibi soğuk sükroz tamponu eklemek için 5 mililitrelik bir pipet kullanın.

Çekirdekleri toplamak için, lizatı 101.814 kez g'de bir saat boyunca ultrasantrifüjleyin ve peleti bozmadan süpernatanı ve kalıntıları dikkatlice aspire edin. Çekirdek peletini yeniden süspanse ederek ultrasantrifüj tüpüne PBS ekleyin.

İzole edilmiş çekirdeklerin floresanla aktive edilen sınıflandırılması için, AlexaFlour555 konjuge fare anti-NeuN antikoru içeren bir antikor çözeltisine yaklaşık 20 mikrolitre yeniden askıya alınmış numune ekleyin. APC konjuge fare anti-PAX6 antikoru içeren bir antikor çözeltisine yaklaşık 20 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş numune ekleyin. Bir saatlik bir inkübasyondan sonra, ışıktan korunarak çalkalayarak 4 santigrat derecede, tüm numunelere ve kontrollere 1 ila 1.000 oranında DAPI ekleyin.