Bir Sıçan Hipokampusundan Çeşitli Nöral Hücre Popülasyonlarının Elde Edilmesi

Perfüze edilmiş sıçan hipokampus parçalarını alın.

Dokunun hücre dışı matrisini sindirmek ve nöronlar, astrositler ve mikroglia dahil olmak üzere hücreleri gevşetmek için papain ile kuluçkaya yatırın.

DNase ekleyin ve karıştırın.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için giderek azalan çaplara sahip pipetler kullanarak dokuyu mekanik olarak ayırın. DNazın kirletici DNA'yı parçalaması için inkübe edin.

Süspansiyonu bir süzgeçten geçirerek kalıntıları temizleyin.

Enzimatik aktiviteyi durdurmak için iki değerlikli iyonlar içeren tampon ekleyin.

Enzim açısından zengin süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Şimdi, tampon ve anti-miyelin manyetik boncuklar ekleyin. Boncukların miyelin kalıntılarını bağlaması için kuluçkaya yatırın.

İnkübasyondan sonra, süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Karışımı tampon içinde yeniden süspanse edin ve manyetik sıralayıcının manyetik alanına yerleştirilmiş ferromanyetik küreler içeren bir manyetik ayırma kolonuna yükleyin.

Manyetik alan, miyelinsiz hücreler geçerken kolondaki manyetik boncuk bağlı miyelin kalıntılarını tutar.

Kolonu tamponla yıkayın ve nöronlar, astrositler ve mikroglia içeren akışı toplayın.

Yetişkin beyin dokularından toplanan her örneği altı oyuklu bir kültür plakasının kapağında 30 ila 400 miligramlık küçük parçalara ayırmak için steril tıraş bıçakları kullanarak nöral ayrışmaya başlayın. Daha sonra dokuyu 1 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'ye daldırın ve numuneleri steril 2 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın.

Tüm dokular toplandığında, numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanları aspire edin ve numuneleri 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin, çöken doku parçalarını yeniden süspanse etmek için tüpü her beş dakikada bir birkaç kez ters çevirin.

İnkübasyonun sonunda, her numuneye 30 mikrolitre taze hazırlanmış enzim karışık tüp ekleyin ve tüpleri yavaşça ters çevirin. Ardından, 1 etiketli bir Pasteur pipeti kullanarak, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek her bir numuneyi 30 yukarı ve aşağı öğütme ile ayırın. Numuneleri her beş dakikada bir ters çevirerek 37 santigrat derecede 15 dakika daha inkübe edin, ardından numunelerin az önce gösterildiği gibi 2 numaralı Pasteur pipeti ile ayrışmasını izleyin.

Ardından 3 numaralı pipete geçin. Ayrışmayı tekrarlayın ve numuneleri her beş dakikada bir ters çevirerek su banyosunda 10 dakika daha inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, tek hücreli süspansiyonları 80 mikron hücreli süzgeçlerden 15 mililitrelik Falcon tüplerine süzün, enzimatik reaksiyonları durdurmak için her süzgeci 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile yıkayın. Son numune filtrelendiğinde, tüpleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanları aspire edin.

Miyelini hücre süspansiyonlarından tüketmek için, peletleri 400 mikrolitre miyelin çıkarma tamponunda iyice yeniden süspanse edin ve her tüpe uygun miktarda miyelin çıkarma boncuğu ekleyin. Hücreler ve boncuklar iyice karışana kadar çözeltileri yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneyi 4 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir numuneyi 5 mililitre miyelin giderme tamponunda yıkayın.

Hücreler dönerken, manyetik bir sıralayıcının manyetik alanına her numune için bir sütun yerleştirin ve her sütunun üzerine 80 mikronluk temiz bir filtre yerleştirin. Her filtreyi ve sütunu 1 mililitre miyelin giderme tamponu ile üç kez durulayın ve tüm akışı bir atık kabında toplayın.

Son durulamadan sonra, elüatı toplamak için 5 mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpleri doğrudan her sütunun altına yerleştirin. Daha sonra, süpernatanı numunelerden aspire edin ve peletleri 500 mikrolitre miyelin giderme tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonlarını hemen sütunlara uygulayın ve hücreleri aşağıdaki tüplerde toplayın. Ardından, her filtreyi ve sütunu yıkama başına 1 mililitre miyelin giderme tamponu ile 4 kez durulayın. Son yıkamadan sonra hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanları aspire edin.