JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:10 dk • July 8th, 2025
Bir kültür ortamında transgenik Caenorhabditis elegans solucanlarından elde edilen hücrelerin bir süspansiyonunu alın.
Süspansiyon, sinir sisteminden gelen nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli dokulardan hücreler içerir.
Transgenik solucanlar, bir veziküler transmembran taşıyıcıya konjuge edilmiş bir floresan proteini eksprese etmek üzere tasarlandı. Nörotransmitter asetilkolini taşıyan sinaptik veziküllerde bulunan bu taşıyıcı, vücuttaki kolinerjik nöronlarda bulunur.
Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Floresanla aktive edilen hücre sıralaması veya FACS için hücreleri taze bir kültür ortamında yeniden süspanse edin.
FACS'ı kullanarak hücre süspansiyonunu analiz edin. Floresan olarak etiketlenmiş kolinerjik nöronlar, uygun bir dalga boyundaki ışığa maruz kaldıklarında floresan yayar ve onları diğer etiketlenmemiş hücrelerden ayırır.
İzole edilmiş nöronları çok kuyucuklu bir plakaya aktarın. Nem seviyesini korumak için hücreleri nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
İzole edilmiş hücre süspansiyonundan hücreleri 10.000 kez g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve akış sitometresinin aşırı yüklenmesini önlemek için L-15 takviyeli ortamdaki peletlenmiş hücreleri mililitrede 6 milyon hücreden fazla olmayan bir hücre yoğunluğuna yeniden süspanse edin. Ardından, numuneleri sıralayabilen bir akış sitometresi kullanarak hücreleri GFP-pozitif ekspresyona göre sıralayın.
GFP negatif hücreler, hücre tipine özgü olmayan analizler için bir kontrol olarak kullanılabilir. Bundan sonra, izole edilmiş hücreleri steril altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Plakayı plastik bir kaba koyun. Hücrelere nem eklemek için nemli bir mendil veya yumuşak kağıt mendil ekleyin ve 20 santigrat derecede inkübe edin.