Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Fare omuriliklerini hasat edin ve parçalara ayırın.

Parçaları bir proteolitik enzim ve DNaz içeren bir tüpe aktarın. Girdap ve kuluçkaya yatırın.

Enzim, dokunun hücre dışı matrisini sindirirken, DNaz, kirletici serbest DNA'yı bozar.

Tekrar vorteksleyin ve doku ayrışmasını tamamlamak için tekrar tekrar pipetleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Hücreleri DNaz ve bir proteaz inhibitörü ve girdap içeren bir çözelti içinde yeniden süspanse edin. İnhibitör enzimi nötralize eder.

Üstüne taze inhibitör solüsyonu koyun, santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Hücreleri yoğunluk gradyan ortamında, girdapta ve ardından santrifüjde yeniden askıya alın.

Hücreler dibe çökerken, miyelin kalıntıları üstte kalır.

Kalıntıları atın. Tampon, santrifüj ile tekrar tekrar yıkayın ve süpernatanı çıkarın. Büyüme ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.

Hücreleri plakalayın. Kaplamasız yüzey, glial hücre bağlanmasını kolaylaştırır.

Harcanan ortamı çıkarın ve glial hücre proliferasyonunu indüklemek için taze ortam ekleyin ve karışık bir glial kültür oluşturun.

Bir doku kültürü başlığında çalışarak, dört fare omuriliğini bir HBSS Petri kabına aktarın. Omuriliklerin her birini küçük parçalara ayırmak için steril makas ve forseps kullanın. Daha sonra parçaları papain DNaz enzim karışımı içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. HBSS'yi enzim karışımına aktarmaktan kaçının çünkü bu, enzimin performansının düşmesine neden olabilir.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için doku parçalarının iyi sindirilmesi çok önemlidir. Bununla birlikte, aşırı sindirim daha az canlı hücre ile sonuçlanacaktır. Her laboratuvarın, hücreleri için en iyi olanı temel alarak tam sindirim süresini belirlemek için pilot testler yapması gerekir.

Daha sonra, tüpü nazikçe girdap haline getirin ve ardından dakikada 150 dönüşte yörünge sallama ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpü girdaplayın ve daha fazla ayrışmayı teşvik etmek için 5 mililitrelik bir pipet kullanarak dokuyu kuvvetlice ezin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında, steril bir tüpte 2.7 mililitre EBSS'ye 300 mikrolitre sulandırılmış albümin ovomucoid inhibitör çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından 150 mikrolitre DNase çözeltisi ekleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini taze hazırlanmış albümin ovomokoid inhibitörü ve DNaz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücre peletini kırmak için iyice girdaplayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonuna DNaz olmadan 3 mililitre sulandırılmış albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 70 kez g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, zar parçaları içeren süpernatanı çıkarın ve peleti tutun.

Ayrışmış omurilik hücrelerinden miyelini çıkarmak için, önce, hücre peletini içeren tüpe 8 mililitre oda sıcaklığında% 20 yoğunluk gradyan ortamı ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında kırılmadan 30 dakika boyunca 800 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, çoğunlukla miyelin içeren üst döküntü tabakasını ve peleti terk eden süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Kalan yoğunluk gradyanını gidermek için, peleti HBSS ile seyreltilmiş 8 mililitre cDMEM ile yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Hücreleri 400 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri daha önce olduğu gibi seyreltilmiş cDMEM ile yıkayın.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet hücreleri tohumlayana kadar buz üzerinde saklanabilir. Kaplama için hazır olduğunda, hücreleri 2-Merkaptoetanol ile takviye edilmiş 14 mililitre cDMEM içinde yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu bir plakada her bir oyuğa 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Kuyucuk başına ortalama hücre sayısını ve kültürün mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilecek plaka ekstra kuyucukları. Hücreler kaplandıktan sonra, hücreleri% 5 karbondioksit ile 35.9 santigrat derecede inkübe edin. Kaplamadan sonraki gün olan 1. günde ortamı değiştirin.

Bazı hücreler kültür plakasına bağlanır, ancak yine de çoğunlukla yuvarlaktırlar. Ayrıca birçok yüzen hücre ve önemli döküntüler vardır. Bundan üç ila dört gün sonra medya değişikliğini tekrarlayın.