$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kültür, ortamdaki multipotent otik progenitör veya iMOP hücrelerini ölümsüzleştirdi.
Ortamdaki büyüme faktörleri, iMOP proliferasyonunu ve koloni oluşumunu kolaylaştırarak otosferler oluşturur.
Otosferleri toplayın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin.
Ortamı çıkarın ve büyüme faktörleri olmayan farklılaşma ortamı ekleyin. Otosferleri plakalayın.
Büyüme faktörlerinin yokluğu, duyusal epitel hücrelerine iMOP farklılaşmasını başlatır.
Farklılaşmış otosferleri toplayın ve yerleşmelerine izin verin.
Ortamı çıkarın ve hücresel morfolojiyi korumak için bir fiksatif ekleyin.
Ardından, hücresel ve nükleer zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjan ekleyin.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.
Spesifik bir farklılaşma belirtecini hedefleyen primer antikorları tanıtın.
Birincil antikorları hedefleyen florofor konjuge ikincil antikorlar, aktini lekelemek için floresan etiketli phalloidin ve çekirdekleri boyamak için DNA bağlayıcı bir boya ekleyin.
Otosferleri monte edin.
Floresan mikroskobu kullanarak, iMOP farklılaşmasını doğrulamak için boyamayı görselleştirin.
Kaplamadan üç gün sonra, daha önce gösterildiği gibi otosferleri toplamak için yerçekimi sedimantasyonunu kullanın. Süpernatanı aspire etmeye devam edin ve hücreleri 2 mililitre duyusal epitelyal farklılaşma ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Ardından, otosferleri 60 milimetrelik yeni bir tabağa aktarmak için 10 mililitrelik geniş delikli bir pipet kullanın. Otosferleri 10 gün boyunca farklılaştırın, kültüre her gün 2 mililitre taze farklılaşma ortamı ekleyin.
Daha sonra, otosferleri yerçekimi, çökeltme yoluyla tekrar hasat edin ve harcanan ortamı aspire edin. Daha sonra, otosferleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1X PBS'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Daha sonra formaldehit çözeltisini çıkarın ve hücreleri% 0.1 Triton X-100 içeren 1X PBS'de yıkayın. %10 keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 ile desteklenmiş 1X PBS'de otosferleri bloke ederek devam edin.
Bir saat sonra, bloke edici tamponu, Cdkn1b veya Cdh1 antikorunun uygun seyreltmesini içeren tamponla değiştirin. Daha sonra, hücreleri gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikorda inkübe edin ve ertesi gün, başka bir yerde tarif edildiği gibi floresan etiketli ikincil antikorlar, phalloidin ve Hoechst kullanarak immün boyamaya devam edin.
Görüntülemeye hazırlanmak için, montaj ortamını bir cam slayt üzerine yerleştirin ve ardından lekeli otosferleri ortama yerleştirin. Ardından, numunenin üzerine bir lamel yerleştirin. Montaj ortamının gece boyunca 4 santigrat derecede kurumasına izin verdikten sonra, slaytı 16 bit CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. 20X 0.75 hava objektifini kullanarak mavi, yeşil, kırmızı ve kızılötesi kanallardan veri toplayarak epifloresan görüntüler elde edin.