Ölümsüzleşmiş Multipotent Otik Progenitörlerin Spiral Ganglion Nöronlarına Ayrılması ve Farklılaşmanın Değerlendirilmesi

Bir hücre kültürü substratı ile kaplanmış steril lameller içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Nöronal farklılaşma ortamında ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitörleri veya iMOP'ları tanıtın.

iMOP'lar, işitsel bilgileri beyne ileten spiral ganglion nöronları veya SGN'ler dahil olmak üzere çeşitli iç kulak hücrelerinin öncüleridir.

Hücrelerin substrata yapışmasına izin vererek inkübe edin. Ortam, iMOP'ların SGN'lere farklılaşmasına neden olur.

Protein çapraz bağlanmasını indüklemek, hücre morfolojisini korumak için bir fiksatif ve hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjan çözeltisi ekleyin.

Spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için bir engelleme reaktifi ekleyin.

Nöronal farklılaşma belirteçleri için spesifik florofor konjuge antikorlar ekleyin ve inkübe edin, böylece antikorların SGN'leri etiketlemesine izin verin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve lamelleri floresan nükleer leke içeren bir montaj ortamı ile monte edin.

Floresan mikroskobu kullanarak, iMOP'ların SGN'lere farklılaştığını doğrulamak için antikor sinyallerini tespit edin.

İlk olarak, yuvarlak cam lamelleri steril 100 milimetrelik bir plakaya yerleştirerek ve% 70 etanole batırarak temizleyin. Örtüldüklerinden emin olmak için lamelleri hafifçe çalkalayın ve tabağı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha sonra, lamelleri steril 1x PBS'de üç kez ve ardından steril su ile bir kez durulayın.

Daha sonra, lamelleri bir doku kültürü başlığında 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak kurumasını bekleyin. Hemen kullanım için, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir steril lamel yerleştirin ve tüm lamellerin düz durduğundan emin olmak için plakayı hafifçe sallayın. Daha sonra, her bir oyuğa mililitre poli-D-lizin mililitresi başına 10 mikrogram içeren 0.25 mililitre 1x PBS ekleyerek lamelleri kaplayın.

Plaka 37 santigrat derecede bir saat inkübe edildikten sonra, poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril 1x PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan gelen sıvı aspire edildikten sonra, 24 oyuğun her birine mililitre laminin başına 10 mikrogram içeren 0.25 mililitre 1x PBS ekleyin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra laminin çözeltisini aspire edin. Daha sonra, her bir kuyucuğu 1 mililitre 1x PBS ile üç kez yıkayın, ancak hücreler kaplanmaya hazır olana kadar PBS'yi kuyucuklardaki son yıkamadan bırakın.

Nöronal farklılaşmaya başlamak için, hücreleri daha önce tarif edildiği gibi ayrışmış otosferlerden sayın ve daha sonra bunları önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Kaplanmış lamellerin bulunduğu plakanın her bir oyuğuna 1 ila 1,5 x 10⁵ iMOP hücresi tohumlayarak devam edin. Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin ve nöronal farklılaşma ortamını her gün değiştirin.

Yedi gün sonra, ortamı aspire edin ve lamellere takılması gereken hücreleri, her bir oyuğa %4 formaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 15 dakika bekleterek sabitleyin. Daha sonra formaldehiti çıkarın ve hücreleri %0.1 Triton X-100 içeren 1x PBS'de bir kez yıkayın. Daha sonra, yıkama tamponunu çıkarın ve her bir oyuğa %10 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren 1x PBS'den oluşan bloke edici tampon ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında bir saat bekletin ve ardından sıvıyı çıkarın ve uygun seyreltilmiş Cdkn1b veya Tubb3 antikorunu içeren bloke edici tampon ile değiştirin. 4 santigrat derecede bir gece inkübasyonun ardından, hücreleri bir kez% 1 Triton X-100 içeren 1x PBS ile yıkayın ve daha önce tarif edildiği gibi immün boyamaya devam edin. Boyama tamamlandıktan sonra, kuyucuklara 1x PBS ekleyerek son bir yıkama yapın.

Bunları analize hazırlamak için, leke hücrelerinin tutturulduğu lamelleri 24 oyuklu plakadan çıkarın ve bunları bir cam slayt üzerindeki montaj ortamına yerleştirin. Montaj ortamının gece boyunca 4 santigrat derecede kurumasına izin verdikten sonra, daha önce açıklandığı gibi epifloresan görüntüleri elde edin.