İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerine Farklılaşması

Hücre sağkalımını destekleyen bir Rho-kinaz inhibitörü içeren bir ortamda insan kaynaklı pluripotent kök hücreler veya iPSC'ler içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

Ortamı, besinler ve büyüme faktörleri içeren temel bir ortamla değiştirin.

iPSC'lerin öncü hücrelere proliferasyonuna ve farklılaşmasına izin vermek için inkübe edin.

Bu besiyerini fibroblast büyüme faktörleri ve retinoik asit ile takviye edilmiş bir farklılaşma besiyeri ile değiştirin, ardından inkübe edin.

Büyüme faktörleri, öncü hücrelerin mikrovasküler endotel hücrelerine farklılaşmasını kolaylaştırırken, retinoik asit sıkı bağlantı proteinlerinin sentezini destekler.

Hücreleri ayırmak için hücreleri bir enzim-EDTA çözeltisi ile yıkayın ve işlemden geçirin, tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.

Hücreleri toplamak ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin. Ardından, hücreleri yeni bir farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.

Bu hücre süspansiyonunu, kollajen ve yapışma proteinleri ile kaplanmış çok kuyucuklu bir plakaya tohumlayın.

Hücre yapışmasına izin vermek için inkübe edin, hücreler arasında sıkı bağlantılar oluşturun, beyin mikrovasküler endotel hücrelerine benzer.

İnsan iPSC'lerinden BMEC farklılaşmasını indüklemek için, hücreleri uygun hacimde enzimatik EDTA ile 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe etmeden önce birleşik iPSC kültürünü DPBS ile bir kez yıkayın.

Tek hücreli bir süspansiyon elde edildiğinde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, sayım için 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş uygun bir hacimde kök hücre ortamında yeniden süspanse edin.

Hücreleri santimetreküp konsantrasyon başına 1.56 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin ve 2 mililitre hücreyi 6 oyuklu düz tabanlı ayrı kuyucuklara tohumlayın. Hücre kültürü inkübatöründe 24 saat sonra, her bir oyuktaki süpernatanı E6 ortamı ile değiştirin ve plakayı dört gün daha inkübatöre geri koyun.

İPSC'den türetilmiş BMEC'leri saflaştırmak için, alt kültür plakalarını oyuk başına uygun hacimde taze hazırlanmış bir kollajen IV ve Fibronektin çözeltisi ile kaplayın ve plakaları 37 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin.

Farklılaşmanın 6. gününde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri B27, bazik fibroblast büyüme faktörü ve retinoik asit ile desteklenmiş uygun hacimde taze insan endotelyal serumsuz ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri, kollajen ve Fibronektin kaplı 24 oyuklu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin.