Civciv Embriyonik Nöronlarının Çok Elektrotlu Bir Dizi Üzerinde İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Erken evre bir embriyo içeren döllenmiş bir tavuk yumurtası alın.

Kabuğu sterilize edin ve dikkatlice açın.

Embriyoyu çıkarın. Kafayı diseke edin ve bir tampon içeren bir kültür plakasına aktarın. Göz küresini çıkarın.

Bir kesi yapın ve ön beyni ve orta beyni açığa çıkararak cilt katmanlarını çıkarın.

İç membranöz tabakayı ve kan damarlarını çıkarın. Ön beyni diseke edin ve bir tampon ile bir kültür plakasına aktarın.

Dokuyu daha küçük parçalara ayırın ve bunları konik bir tüpe aktarın. Parçalar yerleştikten sonra tamponu çıkarın.

Bir proteolitik enzim çözeltisi ekleyin. Dokunun hücre dışı matrisini sindirmek ve nöronları gevşetmek için kuluçkaya yatırın.

Enzim açısından zengin ortamı çıkarın, nörobazal ortamla yıkayın, kalan enzimleri çıkarın.

Nörobazal medya ekleyin. Nöronal bir süspansiyon elde etmek için dokuyu mekanik olarak ayırın.

Bu nöronları, hücre dışı bir matris ile kaplanmış çok elektrotlu bir dizi sistemi üzerine tohumlayın. Nörobazal medya ekleyin ve inkübe edin.

Nöronlar, bir nöronal ağ oluşturarak çıkıntıları bağlar ve uzatır.

Nöron kaplama gününde, -20 santigrat derece dondurucudan bir hücre dışı matris şişesini çıkarın. % 70 etanol püskürtün ve buzun üzerine yerleştirin. Hücre dışı matrisi buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun. ECM 0 santigrat derecenin üzerinde polimerize olduğu için oda sıcaklığında çözdürmeyin.

2 mikrolitrelik alikota 25 mikrolitre soğuk nörobazal ortam ekleyerek hücre dışı matrisi %300'e seyreltmek için BSL-100 davlumbazında çalışın. Ardından, elektrotlara dokunmamaya dikkat ederek çoklu elektrot dizisinin merkezine 100 mikrolitre %25 hücre dışı matris çözeltisi eklemek için bir P200 pipeti kullanın. Yüzeyde ince bir film tabakası bırakarak ECM'yi hemen çıkarın.

Çoklu elektrot dizisini örtün ve nöronları kaplamaya hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir E7 yumurtasının dış kabuğunu %70 etanol ile sterilize ederek civciv nöron izolasyonuna başlayın. Bu noktadan itibaren steril koşulları korumak önemlidir. Tüm aletlerin %70 etanol ile sterilize edildiğinden ve solüsyonların steril olduğundan emin olun. Bir diseksiyon başlığı kullanmak yararlıdır, ancak hızlı bir şekilde yapılırsa diseksiyonlar için kesinlikle gerekli değildir.

Daha sonra, embriyoyu aldıktan ve başını kestikten sonra, göz çevresini kesin ve göz kürelerini çıkarın. Ardından, ventral tarafta bir kesi yapmak için Dumont numarası 5 ince forseps ve yaylı makas kullanın ve ön beyni ve optik tektumu ortaya çıkarmak için cildin dış katmanlarını çıkarın. Kabuk zarını dikkatlice soyun ve çıkarın.

Ön beyni HBS içeren başka bir Petri kabına aktarın ve yaylı makasla yaklaşık 2 milimetrelik küçük parçalar halinde kesin. Ön beyin parçalarını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için steril bir transfer pipeti kullanın. Ön beyin parçaları santrifüj tüpünün dibine battıktan sonra, mümkün olduğunca fazla HBS'yi çıkarın.

Daha sonra, 1 mililitre önceden ısıtılmış% 0.5 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Doku parçalarını rahatsız etmeden tripsini dikkatlice çıkarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. 1 mililitre nörobazal ortam ekleyin ve doku parçalarının dibe çökmesine izin verin. Ortamı çıkardıktan ve yıkamayı tekrarladıktan sonra, 2 mililitre nörobazal ortam ekleyin ve daha fazla doku parçası görülmeyene kadar hafifçe ezin.

Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 1 ila 10 arasında nörobazal ortamla seyreltin ve tripan mavisi boya ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Saydıktan sonra, ilişkili hücreleri milimetre kare başına 2.200 hücre yoğunluğunda ECM kaplı çoklu elektrot dizileri üzerine yerleştirin.