iPSC'den türetilmiş öncü hücreleri kullanarak bir kan-beyin bariyeri çipi oluşturma

Gözenekli bir zarla ayrılmış, üst üste binmiş, matris kaplı kanallara sahip bir mikroakışkan çip alın.

Üst kanalda iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücreleri tohumlayın. Hücre yapışması için inkübe edin, ardından bağlanmamış hücreleri çıkarmak için yıkayın.

Daha sonra, alt kanalda iPSC'den türetilmiş beyin mikrovasküler endotel hücrelerini tohumlayın.

Çipi ters çevirin ve endotel hücrelerini alt kanalın zar tarafına bağlamak için inkübe edin.

Ardından, hücreleri kanalın alt tarafına tutturmak için çipi çevirin ve tek katmanlı tüp benzeri bir yapı oluşturun. Her iki kanalı da hücreye özel ortamla yıkayın.

Sürekli olarak üst kanalda bir nöral farklılaşma ortamı ve alt kanalda bir endotel hücre ortamı akıtın.

Endotel hücreleri, ortamdan olgunlaşmaya kadar büyüme faktörlerini kullanır ve kan damarını andıran sıkı bağlantılar oluşturarak kan tarafını oluşturur.

Nörotrofik faktörler, nöral progenitör hücrelerin çeşitli beyin hücrelerine farklılaşmasını sağlayarak beyin tarafını oluşturur. Bu hücreler endotel hücreleri ile etkileşime girerek çip üzerinde bir kan-beyin bariyeri oluşturur.

Başlamak için, hazırlanan cipsleri içeren tabağı biyogüvenlik kabinine getirin. Bir P200 pipeti kullanarak, girişe 200 mikrolitre nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve sıvıyı çıkıştan çekerek her iki kanalı da nazikçe yıkayın. Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, çipin yüzeyinden fazla ortam damlacıklarını dikkatlice aspire edin.

Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın. Beyin tarafını oluşturmak üzere iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücreleri üst kanala tohumlamak için, üst kanal girişine mililitrede 1 x 10⁶ hücre konsantrasyonunda 30 ila 100 mikrolitre hücre süspansiyonu içeren bir P200 ucu ekleyin ve ucu pipetten yavaşça serbest bırakın.

Pistona bastırmak için boş bir P200 pipeti alın, üst kanal çıkışına yerleştirin ve tek hücreli süspansiyonu uçtan dikkatlice çekin. Üst kanal içindeki hücrelerin homojen dağılımındaki tohumlama yoğunluğunu kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın. Hücre yoğunluğunu% 20 kapsama alanında onayladıktan sonra, çipleri hemen 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Bundan sonra, girişe taze nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve sıvıyı çıkıştan bir pipetle toplayarak bağlanmayan hücreleri yıkayın. Günlük nöral farklılaşma ortamı replasmanı ile hücreleri statik koşullar altında 37 santigrat derecede tutun. iNPC'ler takıldıktan sonra veya tohumlamayı takip eden bir sonraki gün, hazırlanan cipsleri içeren kabı biyogüvenlik kabinine getirin. Alt kanalı 200 mikrolitre endotel hücre ortamı ile nazikçe yıkayın.

Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, çipin yüzeyinden fazla endotel hücre ortamı damlacıklarını dikkatlice aspire edin ve her iki kanalda da ortam bıraktığınızdan emin olun. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın. Bir P200 pipeti kullanarak, mililitre başına 14 ila 20 x 10⁶ hücre konsantrasyonunda 30 ila 100 mikrolitre iPSC'den türetilmiş beyin mikrovasküler endotel hücre süspansiyonu çekin ve ucu alt kanal girişine yerleştirin.

Fonksiyonel bariyer özelliklerini elde etmek için en kritik adım, beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlanmasıdır. Organ kılıfı içindeki homojen dağılımı doğrulamak için kabarcık oluşumunu önlemek için hücreleri uygun yoğunlukta tohumlamak çok önemlidir.

Pistonu boş uçlu bir P200 pipetine bastırın, alt kanal çıkışına yerleştirin ve tek hücreli süspansiyonu alt kanaldan dikkatlice çekmek için pipet pistonunu yavaşça serbest bırakın. Fazla hücre süspansiyonunu çipin yüzeyinden aspire edin. Kanallardan hücre süspansiyonunun aspire edilmediğinden emin olmak için giriş ve çıkış portlarıyla doğrudan temastan kaçının. Tohumlama yoğunluğunu kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın.

Alt kanal, aralarında gözlemlenebilir boşluklar olmayan hücrelerle doldurulur. Doğru hücre yoğunluğunu onayladıktan sonra, hücreleri kalan çiplere tohumlayın. Hücreleri alt kanalın üstünde bulunan gözenekli zara tutturmak için, her bir çipi ters çevirin ve bir çip beşiğinde dinlenmelerine izin verin. Hücrelere nem sağlamak için 150 milimetrelik çanağın içine steril DPBS içeren küçük bir rezervuar yerleştirin.

Çipleri 37 santigrat derecede yaklaşık üç saat veya alt kanaldaki hücreler bağlanana kadar inkübe edin. iPSC'den türetilmiş beyin mikrovasküler endotel hücreleri bağlandıktan sonra, hücrenin alt kanalın alt kısmına bağlanmasına izin vermek için çipleri dik konuma geri çevirin. iPSC'den türetilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlanmasından 48 saat sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derece su banyosunda ısıtarak endotel hücre ortamının sıcaklığını dengeleyin.

Ardından, vakumla çalışan bir filtreleme sistemi altında 15 dakika inkübe ederek ortamın gazını alın. Ardından, taşınabilir modül ambalajının ve tepsilerinin dışını %70 etanol ile sterilize edin, silin ve biyogüvenlik kabinine aktarın. Paketi açın ve modülleri tepsiye yerleştirin. Bunları rezervuarlarla birlikte tepsinin arkasına doğru yönlendirin. Her bir giriş rezervuarına 3 mililitre önceden dengelenmiş sıcak ortamı pipetleyin. Alt kanalın giriş rezervuarına endotel hücre kültürü ortamını ve üst kanalın üst kanal giriş rezervuarına nöral farklılaşma ortamını ekleyin.

Ardından, önceden dengelenmiş 300 mikrolitre sıcak ortamı her bir çıkış haznesine doğrudan her bir çıkış portunun üzerinden pipetleyin. Her tepsiye en fazla 6 taşınabilir modül yerleştirin. Tepsileri inkübatöre getirin ve tepsi sapı dışa bakacak şekilde tamamen kültür modülüne kaydırın. Kültür modülünde ana döngüyü seçin ve çalıştırın. İnkübatör kapısını kapatın ve kültür modülünün taşınabilir modülleri yaklaşık bir dakika boyunca hazırlamasına izin verin.

Durum çubuğunda "Hazır" yazdığında hazırlama döngüsü tamamlanır. Tepsiyi kültür modülünden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine getirin. Taşınabilir modüllerin başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için biyogüvenlik kabinindeki her bir taşınabilir modülün alt tarafını inceleyin. Dört bağlantı noktasının hepsinde küçük damlacıkların varlığına bakın. Herhangi bir taşınabilir modül damlacık göstermiyorsa, bu modüllerde ana döngüyü yeniden çalıştırın. Tepsiye herhangi bir ortam damladıysa, bu daha sık çıkış portlarından oluşursa, tepsiyi %70 etanol ile temizleyin.

Daha sonra, kanaldaki olası kabarcıkları gidermek için her bir çipin her iki kanalını da ılık dengelenmiş hücreye özgü kültür ortamıyla nazikçe yıkayın ve her bir giriş ve çıkış portunun üstüne küçük medya damlacıkları yerleştirin. Taşıyıcılı çipleri taşınabilir modüllere yerleştirin ve her tepsiye altı adede kadar yerleştirin. Tepsileri kültür modülüne yerleştirin. Akış hızı ve esneme gibi uygun organ çipi kültür koşullarını kültür modülü üzerinde programlayın. Yaklaşık iki saat süren Düzenleme döngüsü tamamlanır tamamlanmaz programlanan koşullar başlar. Bundan sonra, kültür modülü önceden ayarlanmış organ-çip kültür koşullarında akışa başlar.