Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Bir tamponda bir fare embriyosu alın ve beyni izole etmek için kafatasını ayırın.

Beyni kaplayan zarlı tabaka olan meninksleri çıkarın.

Yarım küreleri ayırmak için beyni inceleyin.

Dorsolateral telensefalonları hemisferlerden izole edin ve bir tüpe aktarın.

Dorsolateral telensefalonlar nöronlar ve nöral progenitör hücreler açısından zengindir.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Bir enzim çözeltisi ekleyin. Enzimler doku matrisini parçalayarak hücreleri gevşetir.

Serum içeren bir proliferasyon ortamı tanıtın. Serum proteinleri enzim aktivitesini inhibe eder.

Dokuyu mekanik olarak ayırmak ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için bir pipet kullanın.

İnaktive edilmiş enzimler ve doku kalıntıları içeren süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Proliferasyon ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.

Hücreleri hücre kültürü substratı kaplı bir mikroplaka üzerine aktarın.

Hücrelerin substrata yapışması için inkübe edin. Besiyeri progenitör hücre proliferasyonunu kolaylaştırır.

Beyinleri 5 ila 10 E14 embriyosundan soğuk diseksiyon ortamı ile bir Petri kabında çıkararak başlayın. Cildi ve kafatasını dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın ve beyinleri izole edin. Stereomikroskop altında çalışırken, meninksleri çıkarmak için diseksiyon forsepsleri kullanın. Ardından, yarım küreleri ayırmak için telensefalonu ortadan bölün.

Dorsolateral telensefalonu izole etmek için dorsomedial eğri ve pallial-subpallial sınır boyunca kesin. Dorsolateral telensefalonu, tüm beyinler diseke edilene kadar buz üzerinde diseksiyon ortamı olan 2 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dorsolateral telensefalonun mikrodiseksiyonundan sonra, dokuyu 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra, toplanan dokuyu ve soğuk diseksiyon ortamını içeren tüpü, dokuyu çökeltmek için 4 santigrat derecede ve 340 kez g'de 5 dakika santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı pipetle çıkarın ve kimyasal sindirim için 1 mililitre 37 santigrat derece %0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tripsin aktivitesini inhibe etmek için 2 mililitre proliferasyon ortamı ekleyin. Ardından, diyaframı biraz daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya Bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye parlatın. Pipetin ucunu kaplamak için FCS'yi aspire edin. Ardından, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederken yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ateşle parlatılmış ve FCS kaplı Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın.

Ayrışmış hücreleri 4 santigrat derecede 5 dakika ve 340 kez g santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipetle çıkarın. Ardından, 1 mililitre proliferasyon ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. PBS'yi poli-D-lizin ile ön işleme tabi tutulmuş plakadan çıkarın. Ardından, plakanın altına sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işaret çizin.

Hücreleri proliferasyon ortamında ikinci kez yeniden süspanse ettikten sonra,% 0.4'lük bir tripan mavisi çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun 1'e 1 seyreltmesini hazırlayın. Sayma odası slaytlarına yükleyin ve boyanmamış canlı hücrelerin sayısını sayın. Canlı olmayan hücreler mavi olacaktır. Mililitrede 10⁶ hücre elde etmek için hücreleri proliferasyon ortamında seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.