Birincil Fare Orta Beyin Nöronlarını Tasarlanmış Adeno İlişkili Virüslerle Enfekte Etmek
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 5:06 dk. • July 8th, 2025
Bir lamel üzerinde embriyonik bir fare orta beyin hücre kültürü ile başlayın.
Nörona özgü bir promotör altında bir floresan kalsiyum indikatör kompleksini kodlayan tasarlanmış adeno ile ilişkili virüslerle tedavi edin.
Viral bağlanma ve içselleştirme için kuluçkaya yatırın.
Bağlanmamış virüsleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın, ardından bir kültür ortamı ekleyin ve inkübe edin.
İçselleştirilmiş virüsler, genomlarını çekirdekte serbest bırakır, burada nörona özgü promotör, yalnızca birincil nöronlarda kalsiyum indikatör komplekslerinin üretimini yönlendirir.
Bu kompleksler, bir kalsiyum bağlayıcı protein ve bir M13 peptidi ile etiketlenmiş bir floresan proteini içerir.
Lameli kalsiyum iyonları açısından zengin bir kayıt tamponu olan bir tabağa aktarın, ardından canlı konfokal görüntüleme için bir kayıt odasına yerleştirin.
Glutamatın iyon kanallarına bağlanmasına neden olarak kalsiyum iyonlarının girmesine yol açan bir glutamat kayıt tamponu ekleyin.
Bu iyonlar komplekse bağlanarak konformasyonel bir değişikliğe ve floresan emisyonuna neden olur.
Canlı görüntülemede, parlak nöronlar viral enfeksiyonu gösterir.
Tabak başına 1 mikrolitre hSyn-GCaMP6f AAV ile 1 mililitre serumsuz
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin