Birincil Fare Orta Beyin Nöronlarını Tasarlanmış Adeno İlişkili Virüslerle Enfekte Etmek

Bir lamel üzerinde embriyonik bir fare orta beyin hücre kültürü ile başlayın.

Nörona özgü bir promotör altında bir floresan kalsiyum indikatör kompleksini kodlayan tasarlanmış adeno ile ilişkili virüslerle tedavi edin.

Viral bağlanma ve içselleştirme için kuluçkaya yatırın.

Bağlanmamış virüsleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın, ardından bir kültür ortamı ekleyin ve inkübe edin.

İçselleştirilmiş virüsler, genomlarını çekirdekte serbest bırakır, burada nörona özgü promotör, yalnızca birincil nöronlarda kalsiyum indikatör komplekslerinin üretimini yönlendirir.

Bu kompleksler, bir kalsiyum bağlayıcı protein ve bir M13 peptidi ile etiketlenmiş bir floresan proteini içerir.

Lameli kalsiyum iyonları açısından zengin bir kayıt tamponu olan bir tabağa aktarın, ardından canlı konfokal görüntüleme için bir kayıt odasına yerleştirin.

Glutamatın iyon kanallarına bağlanmasına neden olarak kalsiyum iyonlarının girmesine yol açan bir glutamat kayıt tamponu ekleyin.

Bu iyonlar komplekse bağlanarak konformasyonel bir değişikliğe ve floresan emisyonuna neden olur.

Canlı görüntülemede, parlak nöronlar viral enfeksiyonu gösterir.

Tabak başına 1 mikrolitre hSyn-GCaMP6f AAV ile 1 mililitre serumsuz DMEM ortamı hazırlayarak başlayın. Hücre kültürü ortamını her tabaktan aspire edin ve hSyn-GCaMP6f ile hazırlanan DMEM'in 1 mililitresi ile değiştirin. Bulaşıkları bir saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

İnkübasyondan sonra, ortamı AAV'lerle aspire edin ve 3 mililitre hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Bulaşıkları beş ila yedi gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve bu viral enfeksiyon süresi boyunca ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.

El yazması talimatlarına göre 1 litre HEPES kayıt tamponu, 200 mililitre 20 mikromolar glutamat kayıt tamponu ve 200 mililitre 10 mikromolar NBQX kayıt tamponu hazırlayın.

Steril bir 35 milimetre Petri kabını 3 mililitre kayıt tamponu ile doldurun. İnkübatörden enfekte olmuş kültürlerle birlikte Petri kabını alın. Ardından, ince uçlu forseps ile bir lamel kenarını dikkatlice tutun ve kayıt tamponu ile tabağa aktarın.

Kalan lameli orta kısımda 37 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin ve tabağı kayıt tamponu ile konfokal mikroskoba taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın. Başlatılırken peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt arabelleğine yerleştirin. Ardından, akışı dakikada 2 mililitre olarak kalibre edin.

Enfekte lamel peter kabından ince forseps ile kayıt banyosuna aktarın. 10x suya daldırma objektifini ve parlak alan ışığını kullanarak, odak düzlemini bulun ve yüksek yoğunluklu nöron hücresi gövdelerine sahip bir bölge arayın. Ardından, 40x objektife geçin ve örneği yeniden odaklayın.

Boyalar listesi penceresinde AlexaFluor 488'i seçin ve uygulayın. Floroforların aşırı maruz kalmasını ve foto-ağartılmasını önlemek için, düşük HV ve lazer gücü ayarlarıyla başlayın.

AlexaFluor 488 kanalı için HV'yi 500'e, kazancı 1x'e ve ofseti 0'a ayarlayın. 5 lazer çizgisi için gücü %488'e ayarlayın. İğne deliği boyutunu 300 mikrometreye yükseltin ve emisyon sinyallerini alt doygunluk seviyelerine en uygun şekilde ayarlamak için "odak x2" tarama seçeneğini kullanın. Ayarlar daha sonra her kanalın optimum görünürlüğü için ayarlanabilir.

Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücrenin bulunduğu bir bölgeyi bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için istenen düzleme odaklanın.

Görüntüleme çerçevesini bir saniyenin biraz altında bir kare aralığı elde edebilecek bir boyuta kırpmak için "Klip düzeltme" aracını kullanın. Aralık penceresini 1,0 değerine ve num penceresini 600 değerine ayarlayın.

T serisi bir film çekmek için "Zaman" seçeneğini seçin. Ardından, görüntülemeye başlamak için "XYt" tarama seçeneğini kullanın. Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 mikromolar glutamat kayıt tamponuna taşıyın.

Görüntüleme tamamlandığında, "dizi bitti" düğmesini seçin ve bitmiş t serisi filmi kaydedin. Kültürlenmiş nöronların toplam 10 dakika boyunca glutamata maruz kalması için glutamatı 5 dakika daha perfüze etmeye devam edin. Görüntülenecek her lamel için bu işlemi tekrarlayın.