Serumsuz embriyoid cisimciklerin geliştirilmesi ve bakımı

Farklılaştırıcı ortam-1 veya DM-1'de iyi içeren bir nöral progenitör hücre veya NPC agregatları ile başlayın.

Bu NPC'ler, kontrollü koşullar altında DM-1 kullanılarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden veya hiPSC'lerden üretilen nöral soyun öncüleridir.

NPC agregalarını DM-1 içeren bir kuyu içine yerleştirilmiş bir membran ekine aktarın ve fazla ortamı çıkarın.

Ortamı DM-2 olarak değiştirin ve inkübe edin.

DM-2, NPC'lerin farklı nöral hücre tiplerine olgunlaşmasını teşvik eden besinler ve farklılaşma faktörleri sağlar.

Farklılaşmamış NPC'ler, ortamda serum olmadığı için serumsuz embriyoid cisimler veya SFEB'ler olarak bilinen embriyoid cisimlere dönüşür. Bu EB'ler gelişmekte olan bir beynin morfolojisine benzer.

Ek parçayı DM-3 içeren bir kuyuya aktarın.

DM-3, SFEB'lerin bakımı ve büyümesi için gerekli olan büyüme faktörlerini içerir.

SFEB'ler istenen boyuta ulaşana kadar inkübe edin.

Hücrelerin kültürlenmesinden iki hafta sonra, 40 mikron hücre kültürü ekleri ve 1 mililitre DM1 ortamı ile altı oyuklu plakalar hazırlayın. Kültürlenmiş hücreleri eklemeden önce bu plakaları en az dört saat inkübe edin.

Daha sonra, 200 mikrolitrelik geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, yaklaşık 20 mikrolitre ortam içeren iki haftalık hücre agregalarını toplayın. Minimum çözelti ile her bir kesici uç üzerine dört ila altı agrega aktarın. Fazlalıkları giderin.

Bu adım sırasında, hızlı ve sabit bir el ile çalışmak önemlidir. SFEB'lerin etrafından ortamı çıkarırken, yüzey gerilimi nedeniyle SFEB'lerin çözelti boyunca hareket ettiğini görebilirsiniz. Ortam kaldırıldıktan sonra bunları yeniden konumlandırmanızda bir sakınca yoktur.

Tüm agregalar kesici uçlara yüklendikten sonra, ortamı 1 mililitre DM2 olarak değiştirin ve hücreleri kültürlemeye devam edin. Her gün ortamın 3 / 4'ünü taze ortamla değiştirin. 14 günlük kültürden sonra, kültürlere DM3 ortamı eklemeye başlayın. SFEB'leri büyütmek için 16 gün daha kültüre devam edin.