JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:33 dk. • July 8th, 2025
İnsan kornea fibroblastlarını ele alalım.
Bunları, ortam içeren çok kuyulu bir plaka içindeki bir membran ekine aktarın.
Membran ekine ortam ekleyin. Eke fibroblast yapışması için inkübe edin.
Ardından, ortamı zar ekinde ve rezervuarda C vitamini içeren ortamla değiştirin.
Kuluçkaya yatmak. C vitamini, fibroblastları 3 boyutlu hücre dışı bir matris salgılaması ve bir araya getirmesi için uyarır.
Fibroblastların üzerine bir insan nöroblastom hücre süspansiyonu ekleyin.
Nöroblastom hücre yapışmasına izin vererek inkübe edin.
Şimdi, hücrelerin üzerine retinoik asit içeren besiyeri ekleyin ve rezervuarı taze besiyeri ile destekleyin.
Kuluçkaya yatmak. Retinoik asit, nöroblastom hücresinin nöral progenitör hücrelere farklılaşmasını tetikler.
Ardından, medyayı çıkarın. Rezervuara taze ortam ekleyin. Membran ekine nörotrofik faktör içeren bir ortam ekleyin ve inkübe edin.
Nörotrofik faktörler, progenitör hücrelerin nöronlara farklılaşmasını tetikleyerek insan kornea fibroblastları ve nöronlarının 3 boyutlu bir ko-kültür modelini oluşturur.
3D yapıları bir araya getirmek için önce insan kornea fibroblastlarını geçirin ve sayın. Daha sonra, 0,4 mikron gözenekli bir polikarbonat membran eki üzerine yaklaşık 1 kez 10 ila 6 HCF'yi tohumlayın. Yapının üstüne 1,5 mililitre taze ortam ekleyin. Ardından, her yapının altına aynı ortamdan 1,5 mililitre daha pipetleyin.
24 saat sonra, her yapının üstüne ve altına 0,5 milimolar C vitamini takviye edilmiş 1,5 mililitre ortam ekleyin. Üç hafta boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin ve her gün C vitamini içeren taze ortam ekleyin. Bu, hücreleri kendi hücre dışı matrislerini salgılamaları ve bir araya getirmeleri için uyaracaktır. Üç hafta sonra, önceden monte edilmiş 3D yapıların üstündeki 3 SH-SY5Y insan nöroblastom hücresine 8 kez 10 ekleyin.
Bu adımda tam hücre sayısını hesaplamak ve hücre farklılaşmasına başlamadan önce 24 saat beklemek çok önemlidir.
24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri %10 FBS ve 10 mikromolar retinoik asit içeren 1.5 mililitre EMEM ile uyararak SH-SY5Y hücre farklılaşmasını başlatın. Ardından, yapının altına 1,5 mililitre C vitamini içeren ortam ekleyin. Retinoik asit ışığa duyarlıdır, bu nedenle bu adım karanlıkta yapılmalıdır.
Beş gün sonra, hücreler farklılaşma aşamasına ulaştığında, yapının üstüne 2 nanomolar BDNF ve% 1 antibiyotik-antimikotik içeren 1.5 mililitre serum içermeyen ortam ekleyin. Yapının altına taze C vitamini takviyeli ortam ekleyin. Daha fazla analiz için işlemeden önce hücreleri iki gün daha kültürleyin.