$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sabit bir doku örneği içeren bir cam slaytı bir antijen alma tamponuna yerleştirin ve ısıtın.
Yüksek sıcaklık ve tamponun alkalin pH'ı, fiksasyonun neden olduğu protein çapraz bağlarını kırarak antijen epitoplarını açığa çıkarır.
Isıya bağlı doku hasarını önlemek için slaytı soğutun, ardından fazla tamponu çıkarmak için durulayın.
Hidrofobik bir bariyer uygulayın ve slaytı bir nem odasına yerleştirin.
Geçirgenliği engelleyen bir arabellek ekleyin. Tamponun deterjanı hücresel zarları geçirgen hale getirir ve bloke edici proteinler, arka plan lekelenmesini azaltmak için spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskeler.
Fazla tamponu çıkarın, metal konjuge bir antikor kokteyli ekleyin ve antikorun spesifik antijenlere bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.
Slaytı yıkayın, bağlanmamış antikorları çıkarın.
Hücrelere giren ve DNA'ya bağlanan metal konjuge bir nükleer leke ekleyin.
Fazla lekeyi durulayın ve slaytı kurulayın.
Optik bir tarayıcı kullanarak, lekeli numunenin görüntüleme kütle sitometrisi analizinden elde edilen verilerin yorumlanmasına yardımcı olan dokunun yapısal özelliklerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde edin.
İmmün boyama uyumlu bir slayt üzerine monte edilmiş beş mikrometre önceden işlenmiş bir doku kesiti ile başlayın. Slaytları bir slayt posta göndericisine yerleştirin.
Isıya bağlı epitop alımı veya HIER için, doku tamamen daldırılana kadar slayt postasına HIER tamponu ekleyin. Sürgülü posta göndericisini bir örtü açma haznesine yerleştirin ve ısıtma programını başlatın.
Program sona erdikten sonra, slayt postalayıcıyı soğuk suyla dolu bir tepsiye koyun ve soğumaya bırakın. Hacmi kademeli olarak artırarak slaytları birkaç kez damıtılmış suyla durulayın.
Slaytları slayt posta göndericisinden çıkarın ve fazla arabelleği silin. Bloke edici tampon ve antikor kaybını önlemek için, hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak dokuyu çevreleyin.
Slaytları özelleştirilmiş bir nem odasında bir saat boyunca inkübe edin. Spesifik olmayan engelleme için, nem odasındaki slaytlara engelleme tamponu ekleyin. Kuluçka süresinden sonra, fazla bloke edici tamponu çıkarın ve kalan tamponun oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
Antikor çözeltisini doku üzerine dikkatlice ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede bir nem odasında inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, slaytı Triton içeren PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. Son olarak, slaytı PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez durulayın. Şimdi, dokuyu interkalatör boyası ile muamele edin ve otuz dakika boyunca oda sıcaklığında nem odasında inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, slaytı HPLC dereceli suyla beş dakika yıkayın ve otuz dakika boyunca bir kurutucuda kurutun.
Slayt kuruduktan sonra, inç başına 1200 noktadan az olmayan bir çözünürlükte düz yataklı bir belge tarayıcı kullanarak tarayın.