Nöronal Hücrelerden Protein Ekstraksiyonu

Bir lamel üzerine tutturulmuş nöronal kanser hücreleri içeren bir hücre kültürü alın ve soğuk koşullar altında koruyun.

Kültür ortamını çıkarın ve artık ortamı ortadan kaldırmak için hücreleri tekrar tekrar soğuk fosfat tamponu ile yıkayın.

Düşük konsantrasyonda iyonik olmayan deterjan ve proteaz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu ekleyin.

İyonik olmayan deterjan, lizizi başlatmak için hücre zarını bozar.

Bu arada, proteaz inhibitörleri hücresel proteolitik enzimleri bloke ederek proteinleri enzimatik bozulmadan korur.

Ardından, kısmen parçalanmış hücreleri lamel üzerinden çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

İçeriği lizis tamponu içeren bir tüpe aktarın.

Soğuk koşullar altında, hücreleri mekanik olarak parçalamak için bir homojenizatör kullanın, tam hücre lizizini ve protein salınımını sağlayın.

Hücre lizatını santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir tüpe toplayın.

Nöronal tümör hücrelerinden ekstrakte edilen proteinler artık daha fazla analiz için hazırdır.

Protein ekspresyonunun doğrulanması için, transfeksiyondan 48 saat sonra, kültür kaplarını buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her tabaktaki hücrelere 200 ila 400 mikrolitre lizis tamponu uygulayın ve hücreleri lamellerden çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Ayrılan hücreleri her bir plakadan ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri buz altında bir homojenizatör ile daha da ayırın. Bir dakika sonra, homojenize hücre parçalarını santrifüjleme ile peletleyin.