JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:58 dk. • July 8th, 2025
Bir astrosit kültürü alın ve ortamı çıkarın. Fizyolojik bir tampon ekleyin ve hücre yüzeyi proteinlerinin endositozunu inhibe ederek buz üzerinde inkübe edin.
Hücre yüzeyi proteinlerini bağlayan bir biyotinilasyon reaktifi ile inkübe edin.
Daha sonra, reaksiyona girmemiş herhangi bir reaktifi etkisiz hale getirmek için bir söndürme tamponu ile inkübe edin.
Soğuk bir fizyolojik tampon ekleyin ve hücreleri mekanik olarak ayırın. Hücreleri aktarın, ardından süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Hücreleri parçalamak için bir lizis tamponu ile inkübe edin, biyotinile hücre yüzeyi ve biyotinile edilmemiş hücre içi proteinleri serbest bırakın.
Santrifüjleyin, süpernatanı toplayın ve toplam protein içeriğine sahip bir fraksiyonu ayırın.
Kalan fraksiyonu, biyotinile proteinleri bağlayan streptavidin kaplı boncuklarla çalkalama altında inkübe edin.
Hücre yüzeyi proteinine bağlı boncukları döndürün ve hücre içi proteinler içeren süpernatanı ayırın.
Spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak için boncukları çalkalama altında yıkayın, ardından hücre yüzeyi proteinlerini izole ederek süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Toplam, hücre içi ve hücre yüzeyi proteinlerini içeren fraksiyonlar anali
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin