Bir Astrosit Kültüründen Hücre Yüzeyi ve Hücre İçi Proteinlerin İzolasyonu

Bir astrosit kültürü alın ve ortamı çıkarın. Fizyolojik bir tampon ekleyin ve hücre yüzeyi proteinlerinin endositozunu inhibe ederek buz üzerinde inkübe edin.

Hücre yüzeyi proteinlerini bağlayan bir biyotinilasyon reaktifi ile inkübe edin.

Daha sonra, reaksiyona girmemiş herhangi bir reaktifi etkisiz hale getirmek için bir söndürme tamponu ile inkübe edin.

Soğuk bir fizyolojik tampon ekleyin ve hücreleri mekanik olarak ayırın. Hücreleri aktarın, ardından süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Hücreleri parçalamak için bir lizis tamponu ile inkübe edin, biyotinile hücre yüzeyi ve biyotinile edilmemiş hücre içi proteinleri serbest bırakın.

Santrifüjleyin, süpernatanı toplayın ve toplam protein içeriğine sahip bir fraksiyonu ayırın.

Kalan fraksiyonu, biyotinile proteinleri bağlayan streptavidin kaplı boncuklarla çalkalama altında inkübe edin.

Hücre yüzeyi proteinine bağlı boncukları döndürün ve hücre içi proteinler içeren süpernatanı ayırın.

Spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak için boncukları çalkalama altında yıkayın, ardından hücre yüzeyi proteinlerini izole ederek süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Toplam, hücre içi ve hücre yüzeyi proteinlerini içeren fraksiyonlar analiz için hazırdır.

Bu işleme başlamak için, astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve ortamı aspirasyon ile atın. Hücreleri 4 mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin.

CM-PBS'yi aspirasyonla çıkarın ve ardından her bir oyuğa iki mililitre biyotin tamponu pipetleyin. Kültürleri 30 dakika boyunca buzun üzerine koymadan önce tam kaplamayı sağlamak için bulaşıkları birkaç kez hafifçe ileri geri eğin.

Daha sonra, biyotin tamponunu çıkarın, dört mililitre söndürme tamponu ile değiştirin ve kültürleri 10 dakika buz üzerinde tutun. Daha sonra, kültürleri 10 dakika buz üzerinde bırakmadan önce aspire edin ve aynı miktarda söndürme tamponu ile değiştirin.

Ardından, söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Bunu takiben, hücreleri bir mililitre soğutulmuş CM-PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, hücreleri 4 santigrat dereceye ayarlanmış soğutulmuş bir mikrosantrifüjde üç dakika boyunca 100 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Bundan sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, numuneleri her beş dakikada bir girdap yaparak 30 dakika buz üzerinde bırakın. Bunu takiben, herhangi bir deterjan ve çözünür malzemeyi peletlemek için lizatı 14.000 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 50 mikrolitre lizattan tasarruf edin ve üzerine 25 mikrolitre 3x yükleme tamponu ekleyin.

Daha sonra, kuru bir banyoda 95 santigrat derecede ısıtarak denatüre edin. Bu, hem biyotinile hücre yüzey proteinlerini hem de biyotinile edilmemiş sitozolik proteinleri içeren giriş fraksiyonudur. Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, 75 mikrolitre streptavidin agaroz boncuklarını lizata aktarın ve bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Bundan sonra, streptavidin agaroz boncuklarını dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 1.500 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı 50 mikrolitre tasarruf edin ve 25 mikrolitre 3x yükleme tamponu ekleyin. Ardından, bir su banyosunda veya bir ısıtma bloğunda 95 santigrat derecede denatüre edin. Bu, hücre içi fraksiyonu temsil eder ve esas olarak biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerden oluşur.

Daha sonra, peletlenmiş boncukları bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve 4 santigrat derecede üç dakika sallayın. Boncukları peletleyin ve süpernatanı atın. Biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın.

Lizis tamponu kullanılarak 1x'e seyreltilmiş 50 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Boncuklardan biyotin ve streptavidini 95 santigrat derecede denatüre ederek serbest bırakın. Bu fraksiyon sadece biyotinile hücre yüzey proteinleri içermelidir.