JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:38 dk. • July 8th, 2025
Amiloid olmayan proteinler ve çözünmeyen bir protein agregatı olan amiloid fibrilleri içeren bir fare beyin dokusu ekstresi alın.
Katı sükroz ekleyin ve karıştırın, çözeltinin yoğunluğunu artırın.
Daha yoğun proteinleri döküntülerden ayırmak için aktarın ve santrifüjleyin.
Süpernatanı atın, peleti daha yüksek bir sükroz konsantrasyon tamponunda yeniden süspanse edin, karıştırın ve santrifüjleyin.
Birkaç amiloid fibril içeren üst tabakayı yeni bir tüpte toplayın, bir yıkama tamponu ekleyin ve karıştırın.
Şimdi, orta tabakayı atın ve amiloid fibrillerle zenginleştirilmiş peleti, maksimum izolasyon için üst tabaka fraksiyonunu içeren tüpe aktarın.
Kombine fraksiyonları santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bir sindirim tamponu ekleyin ve yalnızca amiloid olmayan proteinleri parçalamak için inkübe edin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Artık sindirilmiş proteinleri çıkarmak için peleti yıkayın.
Peletleri, kalan amiloid olmayan proteinleri çözündüren deterjan içeren sakaroz bazlı bir çözündürme tamponunda yeniden süspanse edin.
Santrifüj, süpernatanı çıkarın ve izole edilen amiloid fibrilleri yeniden askıya alın.
Altı ila sekiz seramik boncuk ve taze hazırlanmış buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içeren iki mililitrelik bir tüpe yeni kesilmiş veya donmuş bir beyin dokusu bölgesi yerleştirerek başlayın. Ardından, dokuyu bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanarak 4.000 RPM'de, 30 saniyelik iki döngü açık ve kapalı darbeyle öğütün. Şimdi, 15 mililitrelik bir tüpte bir mililitre beyin dokusu homojenatına dokuz mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin ve laboratuvar balmumu film şeritleri ile kapatın.
Sağlam çözünmeyi sağlamak için, tüpü gece boyunca 4 santigrat derecede döndürmeye devam edin. Ertesi gün, doku özü süspansiyonuna 1.2 mollük bir nihai konsantrasyona kadar katı sükroz ekleyin. İyice karıştırın ve 4 santigrat derecede 45 dakika boyunca 250.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 1.9 molar sakaroz içeren iki mililitre homojenizasyon tamponu içinde, 4 santigrat derecede 45 dakika boyunca 125.000 kez g'de ezerek ve santrifüjleyerek yeniden süspanse edin.
Santrifüjlemeden sonra, üst beyaz katı tabakayı yeni bir tüpe aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponunda çözündürün. Pelet ayrıca amiloid fibrillerle zenginleştirildiğinden, sulu orta tabakayı atın ve daha yüksek bir verim için peleti üst tabaka ile birleştirin. Kombine fraksiyonları 8.000 kez g'de 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, peleti 1 mililitre buz gibi soğuk sindirim tamponunda yeniden süspanse edin ve bir girdap üzerinde üç saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneyi tekrar santrifüjleyin, ardından peleti 1 mililitre buz gibi soğuk Tris tamponunda iki kez yıkayın ve tekrar santrifüjleyin. İkinci yıkamadan sonra, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mililitre çözündürme tamponunda yeniden süspanse edin ve tüpü 4 santigrat derecede 60 dakika boyunca 200.000 kez g'de hızlı bir şekilde santrifüjleyin.
Peleti saklayın, ardından süpernatana 50 milimolar Tris tamponu ekleyerek sakaroz konsantrasyonunu 1.3'ten 1 molar'a düşürün. Süpernatanı tekrar santrifüjleyin, ardından her iki peleti de %0,5 SDS içeren 100 mikrolitre Tris tamponunda çözün. Amiloid saflaştırması için, 20 döngü boyunca bir banyo sonikasyon cihazında ultrason dalgaları kullanarak amiloid açısından zengin peletleri çözündürün. Ardından, malzemeyi hemen 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin.
Peleti 500 mikrolitre% 0.5 SDS Tris tamponunda tekrar süspanse edin ve yıkamayı dört kez daha tekrarlayın. Son santrifüjleme adımından sonra, peleti 200 mikrolitre ultra saf suda yıkayın ve kalan deterjanı çıkarmak için 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin. Saflaştırılmış amiloid fibrilleri içeren son peleti 100 mikrolitre ultra saf suda çözün.