JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:47 dk. • July 8th, 2025
Nöral indüksiyon ortamında insan serebral organoidlerini içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Organoidler, kök hücreler, radyal glial hücreler, nöral progenitör hücreler veya NPC'ler ve gelişmekte olan beyni taklit eden rozet adı verilen radyal bir düzende düzenlenmiş nöronlar içerir.
Ortamı çıkarın ve organoidleri bir tamponla yıkayın.
Test kuyucuklarına bir tampon içinde süspanse edilmiş Zika virüsü ekleyin ve sadece kontrol kuyularına tamponlayın.
Kuluçkaya yatırın, virüsün NPC'lerdeki reseptörlerine bağlanmasına ve içselleştirilmesine izin verin.
İçselleştirilmemiş virüsleri çıkarmak için yıkayın, ardından taze nöral indüksiyon ortamı ekleyin ve inkübe edin.
İçselleştirilmiş virüsler, yeni viral parçacıklar oluşturmak için konak hücre mekanizmasını kullanır.
Viral çoğalma, apoptozu indükleyen ve organoid gelişimi için mevcut NPC'lerin sayısını azaltan bir hücresel stres tepkisini tetikler.
Zamanla, enfekte organoidler, Zika virüsü ile enfekte olmuş insanlarda anormal beyin gelişimini yansıtan küçültülmüş boyut ve bozulmuş morfoloji sergiler.
Earle'ün 1X Dengeli Tuz Çözeltisini, 1X PBS'yi ve Nöral İndüksiyon ortamını sıcak su banyosunda 37 santigrat dereceye getirin. Daha sonra, 1X Earle'nin çözeltisinde bilinen bir konsantrasyondaki Zika virüsünü, tipik olarak 0.1 ile 10 arasında olan hedef enfeksiyon çokluğuna seyreltin. Bir P200 pipeti kullanarak, tüm ortamı her bir organoid kuyucuğundan dikkatlice çıkarın, ardından organoidleri 200 mikrolitre ılık 1X PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın.
Ortamı her bir oyuktan çıkarırken, organoide dokunmamak veya pipete emmemek çok önemlidir. Bu, organoidde onarılamaz bir hasara neden olabilir. Bu olursa, organoidi atmak en iyisidir.
Ardından, tek kanallı bir P200 pipeti kullanarak kalan tüm sıvıyı her bir organoid kuyusundan dikkatlice çıkarın. Ardından, her bir kuyucuğa hızlı bir şekilde 50 mikrolitre 1x Earle solüsyonu veya Zika virüsü solüsyonu ekleyin. Her organoidin tamamen suya batırıldığından emin olun. Bittiğinde, plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre geri koyun.
Viral bir maruziyet tamamlandıktan sonra. Organoidlerin her bir kuyusunu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın. Organoidlerin 15 saniye oturmasına izin verin ve ardından tek kanallı bir P200 pipeti kullanarak PBS'yi çıkarın. Son olarak, her bir oyuğa 200 mikrolitre taze nöral indüksiyon ortamı ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin.