Bir Serebellar Nöron Kültüründe Çift Boyama ile Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Glial hücre büyümesini inhibe eden, esas olarak serebellar granül nöronları ve az sayıda glial hücre bırakan bir anti-mitotik ajan ile muamele edilmiş bir kültür plakası ile başlayın.

Ortamı çıkarın ve hücre canlılığını korumak için yavaşça soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.

Tamponu soğuk boyama karışımıyla değiştirin ve inkübe edin.

Bu karışım, floresan olmayan bir bileşik olan floresein diasetat veya FDA ve membran geçirimsiz bir floresan boya olan propidyum iyodür veya PI içerir.

FDA, canlı hücrelerdeki fonksiyonel esterazın onu yeşil bir floresan bileşiğine dönüştürdüğü hücrelere yayılır.

PI, hasarlı zarlardan ölü hücrelere girer, DNA'ya bağlanır ve kırmızı floresan yayar.

Boyama solüsyonunu çıkarın ve hücrelerin kurumasını önlemek için soğuk PBS ekleyin.

FDA ve PI lekeleri için floresan görüntüler ve faz kontrast görüntüsü elde edin. FDA ve PI görüntülerini birleştirin.

Daha sonra bu floresan görüntüsünü, büyük glial hücreleri dışlamaya yardımcı olan faz kontrast görüntüsüyle karşılaştırın.

Kırmızı floresan nöronal ölümü gösterirken, yeşil floresan nöronal canlılığı gösterir.

Floresein diasetatı mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve propidyum