Bir Serebellar Nöron Kültüründe Çift Boyama ile Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Glial hücre büyümesini inhibe eden, esas olarak serebellar granül nöronları ve az sayıda glial hücre bırakan bir anti-mitotik ajan ile muamele edilmiş bir kültür plakası ile başlayın.

Ortamı çıkarın ve hücre canlılığını korumak için yavaşça soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.

Tamponu soğuk boyama karışımıyla değiştirin ve inkübe edin.

Bu karışım, floresan olmayan bir bileşik olan floresein diasetat veya FDA ve membran geçirimsiz bir floresan boya olan propidyum iyodür veya PI içerir.

FDA, canlı hücrelerdeki fonksiyonel esterazın onu yeşil bir floresan bileşiğine dönüştürdüğü hücrelere yayılır.

PI, hasarlı zarlardan ölü hücrelere girer, DNA'ya bağlanır ve kırmızı floresan yayar.

Boyama solüsyonunu çıkarın ve hücrelerin kurumasını önlemek için soğuk PBS ekleyin.

FDA ve PI lekeleri için floresan görüntüler ve faz kontrast görüntüsü elde edin. FDA ve PI görüntülerini birleştirin.

Daha sonra bu floresan görüntüsünü, büyük glial hücreleri dışlamaya yardımcı olan faz kontrast görüntüsüyle karşılaştırın.

Kırmızı floresan nöronal ölümü gösterirken, yeşil floresan nöronal canlılığı gösterir.

Floresein diasetatı mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve propidyum iyodürü 10 mililitre PBS'de mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona karıştırarak boyamaya başlayın. FDA PI çözeltisini girdaplayarak karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin. Kültür plakasını buzun üzerine yerleştirin.

Pipet ucuyla hücrelere dokunmadan kültür ortamını dikkatlice aspire edin. Ardından, yavaş yavaş soğuk PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin, ardından soğuk FDA PI veya FDA PI Hoechst çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, FDA PI veya FDA PI Hoechst çalışma solüsyonunu aspire ettikten sonra, her bir oyuğa soğuk PBS ekleyin.

Floresan mikroskobun doğru şekilde kurulduğundan emin olun. FDA PI ve Hoechst için floresan emisyonlarını sırasıyla 520, 620 ve 460 nanometrelerde, 100 ila 300 milisaniye arasında bir maruz kalma süresi ve 2.8X'lik bir analog kazanç kullanarak tespit edin. Floresan görüntüleri topladıktan sonra, Faz Kontrast modunu kullanarak normal ışık altında bir görüntü çekin.

FDA PI çift boyama için, grafik düzenleme yazılımında FDA pozitif katmanı PI pozitif katmanın üzerine sürükleyerek hücrelerin görüntülerini kaplayın. Katmanlar panelinin opaklık alanına %50 girerek FDA pozitif katmanın opaklığını ayarlayın. Katman menüsünü açıp Görüneni Birleştir düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin. Görüntü, Ayarlamalar, Parlaklık/Kontrast altındaki kontrast alanına 50 girerek üst üste bindirilen görüntülerin kontrastını ayarlayın. Bindirme görüntülerinde FDA ve PI çift pozitif hücre olmadığını kontrol edin.

FDA PI Hoechst üçlü boyama için, FDA pozitif katmanı PI pozitif tabaka üzerinde sürükleyerek, FDA pozitif tabakanın opaklığını ayarlayarak ve görüntüleri daha önce olduğu gibi birleştirerek hücrelerin görüntülerini üst üste bindirin. Ardından, Hoechst pozitif katmanını birleştirilmiş katmana sürükleyin.

Katmanlar panelinin opaklık alanına %50 girerek Hoechst pozitif katmanın opaklığını ayarlayın ve Katman menüsünü açıp Görüneni Birleştir düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin. Floresan modunda çekilen görüntüleri Faz Kontrast modunda çekilen görüntülerle karşılaştırarak büyük, düzensiz glial hücreleri serebellar granüler nöronlardan görsel olarak ayırt edin.