JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 5:20 dk • July 8th, 2025
Vahşi tip ve mutant Drosophila beyinlerini bir fiksatif ve bir deterjan içeren bir çözeltiye yerleştirin. Hafifçe sallanarak kuluçkaya yatırın.
Fiksatif, doku morfolojisini korurken, deterjan hücre zarlarını geçirgenleştirir.
Beyinlerin yerleşmesine izin verin, ardından çözeltiyi çıkarın.
Mendilleri bir tampon ile yıkayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme solüsyonu ekleyin.
Çözeltiyi çıkarın ve beynin mantar gövdesinde veya MB nöronlarında aksonal gelişimi düzenleyen spesifik bir proteini hedefleyen birincil antikorlar ekleyin.
Antikor bağlanmasını teşvik etmek için kuluçkaya yatırın.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Primer antikorları hedef alan florofor konjuge sekonjene sekonder antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tekrar yıkayın, ardından beyinleri bir montaj ortamında yeniden süspanse edin.
Beyinleri bir köprü kızağına monte edin ve onları bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.
Vahşi tiple karşılaştırıldığında, mutant beyinler, aksonal yanlış projeksiyonlar ve eksik MB lobları ile kusurlu bir fenotip sergiler.
Mikroskop altında, aynı genotipte 10 ila 15 disseke beyni, PTN içinde seyreltilmiş% 4 paraformaldehit ile doldurulmuş 0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir P200 pipeti kullanın. Ardından, beyinleri oda sıcaklığında yavaşça sallayarak 20 dakika kuluçkaya yatırın. Fiksasyonun ardından, beynin tüpün dibine yerleşmesine izin verin, ardından fiksatifi çıkarın.
Ardından, yıkama başına 500 mikrolitre PTN ile iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Beyinler tüpe yerleşir yerleşmez PTN'yi değiştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında hafif çalkalama kullanarak PTN ile üç uzun yıkama yapın.
Bu yıkamaları takiben, beyinler gece boyunca PTN'de 4 santigrat derecede saklanabilir. Son PTN yıkamasını çıkardıktan sonra, beyinleri oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca 0,5 mililitre bloke edici solüsyonda ve hafif çalkalama ile inkübe edin. Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikorları ekleyin ve beyinleri hafif çalkalama ile iki gün boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
5 yıkamalı PTN yıkama alayını kullanarak birincil antikoru çıkarın ve ardından ikincil antikorları uygulayın. Bu antikorların, sallanma ile ışıktan korunurken oda sıcaklığında üç saat boyunca dokularla inkübe etmesine izin verin.
Beyinleri ikincil antikor solüsyonunda inkübe ettikten sonra, her yıkamadan sonra numuneleri folyo ile kaplayarak PTN yıkama alayını uygulayın ve mümkün olduğunca fazla tamponu çıkararak bitirin. Ardından, 75 mikrolitre floresan solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı ekleyin ve beyinleri ve ortamı pipet ucunun içine ve dışına yalnızca bir kez akıtın. Tüp daha sonra folyoya sarılabilir ve birkaç gün boyunca 4 santigrat derecede saklanabilir, ancak ideal olarak doğrudan montaja devam edin.
Beyinleri monte etmek için bir köprü kaydırağı oluşturun. Pozitif yüklü bir kızak üzerine yaklaşık 1 santimetre aralıklarla iki taban lamel yerleştirin. Pozitif yüklü sürgünün yüzü yukarı bakacak şekilde olduğundan emin olun. Ardından, lamelleri parmak oje ile slayta yapıştırın ve devam etmeden önce cilanın tamamen kurumasını bekleyin.
Ardından, slaytı bir stereomikroskop altına yerleştirin ve lameller arasındaki boşluğa beyinleri ve ortamı pipetleyin. Beynin görselleştirilmesini iyileştirmek için aydınlatmayı ayarladığınızdan emin olun.
Ardından, beyinlerden kaçınmak için dikkatli olarak slayttan ekstra montaj ortamını aspire edin. Ardından, kalan fazla montaj ortamını fitilleyin. Bu, beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır.
Şimdi forseps kullanarak, beyinleri anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzenine yönlendirin. Ardından, beyinlerin üzerine bir lamel yerleştirin ve taban lamellere tutturulmuş üst lamel kenarlarını kapatmak için parmak oje kullanın. Şimdi, orta boşluğu yeni montaj medyası ile damla damla yükleyin ve medyanın kılcal hareket ile lamel altına çekilmesine izin verin. Boşluk dolduğunda, şeffaf parmak oje kullanarak tamamen kapatın.