JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:51 dk. • July 8th, 2025
Ortam içeren çok kuyucuklu bir plakada mikroglial kültürler alın.
Test kuyusundaki ortamın yarısını gümüş nanopartiküller içeren ortamla ve kontrol kuyusundaki ortamla değiştirin. Kuluçkaya yatmak.
Mikroglia, nanopartikülleri içselleştirir, aktive olur ve proinflamatuar sitokinleri serbest bırakır.
Araç ortamını ve bu sitokinleri içeren şartlandırılmış ortamı toplama tüplerine takılan filtrelere aktarın.
Sitokinleri koruyarak nanopartikülleri çıkarmak için santrifüjleyin.
Filtreleri yeni toplama tüplerine ters çevirin, santrifüjleyin ve ortamı toplayın. Yeni ortam ekleyin.
Sonra, hipotalamik nöronal kültürleri alın.
Kontrol kuyusu ortamının yarısını araç ortamıyla ve test kuyusu ortamını şartlandırılmış ortamla değiştirin. Kuluçkaya yatmak.
Sitokinler, hipotalamik nöronlar üzerindeki reseptörlere bağlanarak nöronal ölümü indükleyen sinyal yollarını aktive eder.
Resazorin ekleyin ve inkübe edin.
Canlı hücrelerde, dehidrojenaz enzimleri zayıf floresan resazurin'i floresan resorufin'e indirger.
Floresanı ölçün.
Azalan floresan, artmış hipotalamik nöronal ölümü gösterir ve bu da nanopartikül kaynaklı nörotoksisiteyi düşündürür.
Başlamak için, her bir plaka kuyusundan 200 mikrolitre süpernatan ortam toplayın ve bir mikrosantrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş nanopartikülleri çıkaracak bir filtreye yükleyin.
Nanopartikülleri filtrelerken, boyutlarının, şekillerinin ve konsantrasyonlarının filtrasyon verimliliğini etkileyeceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle filtrasyonu önceden test etmeniz önerilir.
Şimdi, tüpleri oda sıcaklığında 14.000 g'da 15 dakika döndürün. Ardından, nanopartikülleri içeren akışı atın ve filtreleri yeni toplama tüplerine baş aşağı yerleştirin. Sitokin içeren konsantre, şartlandırılmış ortamı toplamak için filtreleri iki dakika boyunca 1.000 g'da baş aşağı döndürün.
Daha sonra, taze yapılmış takviye edilmiş DMEM ile koleksiyonun hacmini 400 mikrolitreye çıkarın ve tüpleri buz üzerinde saklayın. Bu test için, mikroglial kültürler oluşturmak için açıklanan yöntemlerin aynısını kullanarak donmuş stoklardan hipotalamik hücreler oluşturun. Sonuç olarak, bunları 200 mikrolitre takviye edilmiş DMEM'de oyuk başına 5.000 hücre ile siyah duvarlı, şeffaf tabanlı plakaları tohumlamak için kullanın.
24 saatlik kültürlemeden sonra, 100 mikrolitre ortamı çıkarın ve aktive edilmiş mikroglial hücre kültürlerinden toplanan 100 mikrolitre filtrelenmiş ve konsantre ortam ile değiştirin. Ardından, plakayı standart koşullar altında 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, her oyuğa 22 mikrolitre resazurin reaktifi ekleyin ve inkübasyona 20 dakika devam edin. Ardından, çok modlu bir spektrofotometre ile, hücrenin canlılığını bağıl floresan birimleri cinsinden tahmin etmek için bir floresan ölçümü yapın.