JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:46 dk. • July 8th, 2025
Nöral krest hücrelerini içeren sabit fare embriyonik kraniyofasiyal dokularının kriyoseksiyonlarını alın.
Gömme ortamını çıkarmak ve zarları geçirgen hale getirerek hücre içi hedeflere erişim sağlamak için iyonik olmayan bir deterjan içeren tampondaki bölümleri yıkayın.
Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini doyurmak için engelleme çözümü ekleyin.
Fazla engelleme solüsyonunu çıkarın. Daha sonra, transkripsiyon faktörleri ve proliferasyon belirteçleri gibi nükleer antijenleri hedefleyen birincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Antijene bağlı primer antikorlara bağlanmak için florofor konjuge sekonje sekonder antikorlarla inkübe edin.
Tampon kullanarak bağlanmamış antikorları çıkarın.
Floresan nükleer boya ile solmaya karşı dayanıklı bir ortam ekleyin ve bir lamel ile örtün.
Boya çekirdekleri lekeler ve solma önleyici ortam, görüntüleme sırasında floresan sinyallerini korur.
Nöral krest hücre proliferasyonunu ve sinyalleşme aktivitesini gösteren nükleer belirteç ekspresyonunu ve lokalizasyonunu değerlendirmek için bölümleri bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
OCT'yi yıkamak ve bölümleri geçirgen hale getirmek için slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez% 0.1 PBST'de durulayın. Her slayta 200 mikrolitre engelleme solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı durulamadan bloke edici solüsyonu çıkarın. Her slayta bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre primer antikor ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Slaytları PBS ile her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez oda sıcaklığında, hala ışıktan korunarak durulayın. Slaytları monte etmek için, her slayta DAPI ile iki damla solma önleyici ortam ekleyin. Bir lamel ile örtün ve görüntü almaya hazır olana kadar 4 santigrat derecede saklayın.