$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İstediğiniz plazmidi serumsuz ortamda alın. Bu plazmit, veziküle özgü proteinleri floresan etiketlerle kodlar.
Başka bir tüpte, serum içermeyen ortamda seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini alın.
İki çözeltiyi karıştırın ve inkübe edin.
Transfeksiyon reaktifi, plazmit ile birleşerek bir kompleks oluşturur.
Serum ile ortamda iyi bulunan yapışkan nöronları alın. Kompleksleri ekleyin ve inkübe edin. Kompleks, plazmidin hücreye girişini kolaylaştırır.
İçselleştirilmemiş kompleksleri çıkarmak için ortamı atın.
Taze ortam ekleyin ve ardından inkübe edin.
Plazmid, kopyalanmak üzere çekirdeğe girer ve daha sonra nöronlardaki vezikülleri etiketleyen veziküle özgü floresan proteinlere çevrilir.
Kontrollü sıcaklık altında bir floresan mikroskobu kullanarak, belirli zaman aralıklarında görüntüler elde edin.
Görüntüleri analiz etmek için izleme parametrelerini tanımlayın.
İlgilenilen keseciği tanımlayın ve görüntülerin her birinde koordinatlarını kaydedin.
Vezikülün hareketini görselleştirmek için verileri derleyin.
Bu prosedürde, 4 mikrogram plazmidi 200 mikrolitre serumsuz ortamla karıştırın. Ayrı bir tüpte, sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktifini 200 mikrolitre serumsuz ortamda seyreltin. Ardından, çözeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, plazmit çözeltisini ve transfeksiyon reaktif çözeltisini karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bunu takiben, karışımı kaplanmış cam alt tabaklara ekleyin.
Nöronları 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, ortamı 2 mililitre serebral kortikal kültür ortamı ile değiştirin ve nöronları bir ila iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Görüntüleme için, 40x objektif lensli bir CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. Bir inkübasyon sistemi kullanarak sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun. Görüntü edinme yazılımı tarafından kontrol edilen 100 saniyelik bir süre boyunca her 5 saniyede bir 1 karede nöron görüntüleri elde edin.
Görüntüleri analiz etmek için, tüm sıralı görüntüleri manuel izleme ile ImageJ yazılımında açın. Sıralı görüntüleri birleştirmek için, Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı ve ardından Yığınlanacak Görüntüler'i seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Bundan sonra, Eklentiler'i ve ardından Manuel İzleme'yi seçin. Bir izleme penceresi açılacaktır. Parametreleri Göster onay kutusuna tıklayın ve parametreler bölümünde izleme parametrelerini tanımlayın.
Ardından, yeni bir parça başlatmak için Parça Ekle'ye tıklayın. İlgilenilen vezikülleri belirledikten sonra, XY koordinatlarını kaydetmek için sıralı görüntülerdeki sinyallerin merkezine tıklayın. Tüm sıralı görüntülerden veziküllerin XY koordinatlarını toplamak için bu prosedürü tekrarlayın. Her görüntü, referans noktası seçildikten sonra otomatik olarak ardışık görüntüye ilerler.