Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

İstediğiniz plazmidi serumsuz ortamda alın. Bu plazmit, veziküle özgü proteinleri floresan etiketlerle kodlar.

Başka bir tüpte, serum içermeyen ortamda seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini alın.

İki çözeltiyi karıştırın ve inkübe edin.

Transfeksiyon reaktifi, plazmit ile birleşerek bir kompleks oluşturur.

Serum ile ortamda iyi bulunan yapışkan nöronları alın. Kompleksleri ekleyin ve inkübe edin. Kompleks, plazmidin hücreye girişini kolaylaştırır.

İçselleştirilmemiş kompleksleri çıkarmak için ortamı atın.

Taze ortam ekleyin ve ardından inkübe edin.

Plazmid, kopyalanmak üzere çekirdeğe girer ve daha sonra nöronlardaki vezikülleri etiketleyen veziküle özgü floresan proteinlere çevrilir.

Kontrollü sıcaklık altında bir floresan mikroskobu kullanarak, belirli zaman aralıklarında görüntüler elde edin.

Görüntüleri analiz etmek için izleme parametrelerini tanımlayın.

İlgilenilen keseciği tanımlayın ve görüntülerin her birinde koordinatlarını kaydedin.

Vezikülün hareketini görselleştirmek için verileri derleyin.

Bu prosedürde, 4 mikrogram plazmidi 200 mikrolitre serumsuz ortamla karıştırın. Ayrı bir tüpte, sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktifini 200 mikrolitre serumsuz ortamda seyreltin.