Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bir tamponda kimyasal olarak sabitlenmiş vahşi tip ve transgenik Drosophila torasları ile başlayın.

Transgenik toraklarda, dorsal longitudinal kasların nöromüsküler kavşakları, nörodejenerasyonu indükleyen mutant bir proteini eksprese eden nöronlar içerir.

Tamponu çıkarın ve bisection sırasında doku hasarını önlemek için torasları hızlı dondurun.

Taze tampon ekleyin ve torasları diseksiyon tabaklarına aktarın.

Toraks ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın ve orta hattı ortaya çıkarmak için sinir hücresi kümelerini çıkarın.

Hemitoraces elde etmek için orta hat boyunca ikiye bölün.

Fazla dokuyu çıkarın.

Membranları geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için hemitorasları bir bloke edici tampon içinde inkübe edin.

NMJ nöronlarında ve kas aktin filamentlerinde eksprese edilen bir glikoproteini hedefleyen florofor konjuge antikorlar ekleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Hemitrokesleri bir köprü kızağı üzerine yerleştirin, montaj ortamı ekleyin ve dokuları monte edin.

Mikroskop altında görselleştirin.

Vahşi tiple karşılaştırıldığında, mutantlar, nörodejenerasyonu gösteren azalmış nöronal lekelenme gösterirken, kaslar bozulmamış floresan sergiler.

Bisection'lara başlamadan önce, kriyoprotektif eldivenler ve koruyucu gözlükler takın ve bir Dewar şişesini sıvı nitrojenle doldurun. Tüylü bir bıçağı belirli bir açıyla tutmak için bir bıçak kırıcı kullanın ve küçük bir parçayı koparmak için bıçağı bükün. Bıçağı yerine kilitlemek için bıçak kesiciyi kullanın ve numune tüplerinden tüm PBS'yi çıkarmak için bir cam Pasteur pipeti kullanın.

Tüpleri sıvı nitrojen şişesine batırmak için kriyojenik cımbız kullanın. 10 saniye sonra, buz üzerindeki her tüpe yaklaşık 300 mikrolitre buz gibi soğuk PBS eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın ve buz gibi soğuk PBS içeren 10 santimetrelik silikon elastomer kaplı bir diseksiyon kabına bir toraks ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Göğüs kafesini konumlandırmak için donuk bir forseps çifti ve göğüs kafesinin orta hattını ortaya çıkarmak için torasik gangliyonların bir kısmını çıkarmak için ince bir forseps çifti kullanın.

Göğüs kafesinin orta hattını kılavuz olarak kullanarak, göğüs kafesinin üçte birinden sığ bir kesim yapmak için bıçağı kullanın ve göğüs kafesini 45 derecelik bir açıyla konumlandırmak için künt forsepsleri kullanın. İki hemotoras elde etmek için göğüs kafesinin orta hattını düz bir şekilde kesmek için bıçağı kullanın ve dorsal uzunlamasına kaslara zarar vermeden fazla dokuyu çıkarmak için dikkatlice bir veya iki kesim yapın. Ardından, kas dokusu örneklerini uygun şekilde etiketlenmiş bir PBS tüpüne yerleştirin.

Tüm toraks örnekleri ikiye bölündüğünde, dokuları 4 santigrat derecede en az bir saat boyunca bloke edici tamponda geçirgen hale getirin. İnkübasyonun sonunda, taze hazırlanmış yapısal leke çözeltisini girdaplayın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde iki saatlik bir inkübasyon için her numuneye 150 mikrolitre leke ekleyin. Boyamadan sonra, numuneleri PBST'de yıkayın ve 15 mililitre aralıklarla istiflenmiş ve ikiye kesilmiş beş takviye etiketini bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin.

Torasları her slayta aktarmak için modifiye edilmiş bir mikropipet ucu kullanın ve fazla PBST'yi çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın. Numuneleri, göğüs kasları kas tarafı yukarı bakacak şekilde düzenlemek için forseps kullanın. Numuneler doğru şekilde yönlendirildiğinde, her slayta 70 mikrolitre montaj ortamı uygulamak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve her slaytı bir lamel ile kapatın. Ardından, her bir doku etrafında tam bir sızdırmazlık elde etmek için lamellerin dış kenarlarını cömertçe kaplamak için oje kullanın.