İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Dopaminerjik Nöronal Organoidlerin Üretilmesi

İnsan embriyonik kök hücrelerini veya hESC'leri hücre dışı matris kaplı bir şişede alın.

Ortamı bir nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin ve inkübe edin, hESC'leri nöral progenitör hücre veya NPC kolonilerine farklılaştırın.

Kolonileri ayırmak için enzimatik çözelti ekleyin.

Santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve NPC farklılaşmasını desteklemek için büyüme faktörleri içeren bir indüksiyon ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.

Üç boyutlu nöroküreler oluşturmak için hücre süspansiyonunu ters piramidal şekilli mikro kuyulara ekleyin.

Nöroküreleri, büyüme faktörleri ve küçük moleküller içeren bir farklılaşma ortamı içeren hücre dışı matris kaplı bir plakaya aktarın. Dopaminerjik progenitör nöronlara farklılaşmayı teşvik etmek için ajitasyon altında inkübe edin.

Ortamı nöral olgunlaşma ortamı ile değiştirin ve nöroküreleri, hava ve besinlerin difüzyonuna izin verecek şekilde bir kültür kuyusu ekinde bir zar diski üzerine yerleştirin.

Olgun dopaminerjik nöronlardan oluşan üç boyutlu organoidler oluşturmak için statik koşullar altında inkübe edin.

Gelişmekte olan bir beyni taklit eden bu organoidler, Parkinson hastalığının bir özelliği olan dopaminerjik nöron dejenerasyonunu incelemek için faydalıdır.

hESC'lerin pluripotens özelliklerini korumak için kullanılan kök hücre ortamını, nöral indüksiyonu başlatmak için çift SMAD inhibisyon kokteyli ve ertesi gün geçiş sırasında hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren serumsuz bir ortamla değiştirin. Birinci gün, aynı konsantrasyonda ROCK inhibitörü ve çift SMAD inhibisyon molekülleri içeren serum içermeyen ortam kuyusu başına 2.5 mililitre ile mikro kuyu plakasını hazırlayın.

Hücreleri nöral tüp ventral paternine doğru farklılaştırmak için, mililitre başına 100 nanogramda SHH ve FGF8 ve iki mikromolar yumuşatılmış agonist ekleyin. Ortamı ekledikten sonra, mikro kuyulardan hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı beş dakika boyunca 1.200 kez g'de santrifüjleyin. Mikrokuyu plakası yarı farklılaştırıcı ortam ile kullanıma hazır olduğunda, hESC'lerin ortamını çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum klorür içermeyen PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın.

Bir T7.5 şişesine 75 mL rekombinant enzimatik çözelti ekleyerek kolonileri tek hücreli bir süspansiyona ayırın. Hücreleri 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve ardından 7.5 DMEM F-12 ekleyin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu toplayın ve beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve mikrokuyu plakasını hazırlamak için kullanılan aynı ortamdaki hücreleri sayın.

2,5 mililitre ortamda 4,7 milyon hücre hazırlayarak ve bunu plakaya önceden yerleştirilmiş olan önceki 2,5 mililitre ortama ekleyerek, mikro kuyu başına 1.000 hücre içeren nöroküreler oluşturmaya izin veren bir hücre süspansiyonu elde etmek için orta hacmi ayarlayın. Hücreleri her bir mikrokuyuda doğru bir şekilde dağıtmak için, plakayı hafifçe sallayın ve beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, küreler oluşturmak için plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İkinci günde, mikro kuyucukları ortamla nazikçe yıkayın ve küreleri doku ile muamele edilmiş altı kuyulu bir plakaya aktarın. Küreleri 37 santigrat derecede rotasyona yerleştirin ve ortamın yarısını her iki ila üç günde bir taze ortamla değiştirin. 3. ila 13. günlerde, nöral indüksiyonu geliştirmek ve orta beyin kimliğine sahip nöral progenitörlere dönüştürmek için, ortamı üç mikromolar GSK-3-beta inhibitörü ile destekleyin. Küre yoğunluğunu azaltmak ve küre toplanmasını önlemek için numuneyi dokuyla işlenmiş altı kuyucuklu iki yeni plakaya bölün.

Sekizinci günde, büyüme faktörleri ile yeni ortama geçerek nöral olgunlaşmaya başlayın ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. 21. günde, yeni bir altı oyuklu plakanın bir oyuğuna bir kültür plakası eki yerleştirin ve zar ekinin altına nörosfer farklılaşması için kullanılan 1.2 mililitre nöral olgunlaşma ortamı ekleyin. Ardından, PTFE membranını bir kültür plakası ekine yerleştirin.

Son olarak, nöral organoidi oluşturmak için, PTFE zarı üzerindeki hava-sıvı arayüz koşulları altında yaklaşık 100 nöroküre tohumlayın. Bu adımdan itibaren döndürmeyi durdurun ve gerekli farklılaşma zaman noktası elde edilene kadar ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.