Nöral Progenitör Hücrelerde ve Nöronlarda Sialoglikoproteinlerin İmmünofloresan Boyanması

Bir sialik asit raportörü tarafından etiketlenen sialoglikoproteinlere sahip birincil nöral kök ve progenitör hücreleri ve nöronları alın.

Hücreleri sabitlemek için paraformaldehit ekleyin. Tampon kullanarak fazla paraformaldehiti çıkarın.

Biyotin bazlı kimyasal problar, bir indirgeyici ajan ve metal bazlı bir katalizör içeren bir reaksiyon karışımı ile inkübe edin.

İndirgeyici ajan, sialoglikoproteinlerin biyotinilasyonunu kolaylaştırarak katalizörü aktive eder.

Reaksiyon karışımını çıkarın ve tampon ile yıkayın. Biyotinile sialoglikoproteinleri bağlamak için florofor konjuge streptavidin ekleyin.

Bağlanmamış streptavidini çıkarın ve tampon ile yıkayın. Spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek ve hücrelere nüfuz etmek için proteinler ve iyonik olmayan bir deterjan ekleyin.

Bu çözeltiyi çıkarın ve spesifik hücresel proteinleri hedef alan birincil antikorlarla inkübe edin.

Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Proteine bağlı birincil antikorları bağlamak ve çekirdekleri etiketlemek için florofor etiketli ikincil antikorlar ve bir floresan boya ile inkübe edin.

Bağlanmamış molekülleri çıkarın. Tampon ile yıkayınız.

Floresan mikroskobu kullanarak, floresan sialoglikoproteinleri ve hücresel proteinleri görselleştirmek için hücreleri görüntüleyin.

İlk olarak, ekleri kokültür plakalarından çıkarın ve kültür ortamını kuyucukların dibinden aspire edin. Daha sonra, nöral hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi kuyulardan aspire edin ve her bir oyuğa PBS'de 1 mililitre önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Ardından, hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve her bir oyuğa 1 mililitre taze hazırlanmış biotin konjuge tampon I ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, reaksiyon tamponunu kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Her bir hücre oyuğuna 1 mililitre boyama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, boyama tamponunu kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. Her bir hücre oyuğuna 1 mililitre bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Blokaj tamponunu kuyucuklardan çıkarın ve her oyuğa 1 mililitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Hücreleri gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini kuyucuklardan çıkarın. Hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. PBS'yi kuyucuklardan aspire edin ve her oyuğa 1 mililitre ikincil antikor ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Bundan sonra, çözeltiyi kuyulardan aspire edin ve hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın.