JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:18 dk. • July 8th, 2025
Bir ortamdaki bir fare embriyosundan nöronları içeren çok kuyulu bir kültür slaydı ile başlayın.
Nöronlar, büyüyen aksonlarının uçlarında büyüme konileri sergiler. Bu yapılar, hücre iskeletinin bileşenleri olan aktin filamentleri ve mikrotübüllerden oluşan filopodia adı verilen ince çıkıntıları ve lamellopodia adı verilen tabaka benzeri uzantıları içerir.
Test kuyucuklarını toplanmış amiloid-β veya Aβ proteini ile ve kontrol kuyularını bir araç çözeltisi ile muamele edin.
Test kuyularında, toplanmış Aβ, membran reseptörlerine bağlanarak, hücre iskeleti düzenleyici proteinleri fosforile eden aşağı akış sinyalizasyonunu başlatır.
Fosforile proteinler, aktin filamentlerini ve mikrotübülleri bozarak büyüme konisinin yapısal bütünlüğünü bozar ve çökmesine neden olur.
Hücresel yapıyı korumak için bir fiksatif ile inkübe edin, ardından hücreleri yıkayın ve görüntüleme için monte edin.
Bir mikroskop kullanarak, test ve kontrol kuyularındaki hücresel yapıları karşılaştırın.
Aβ ile tedavi edilen nöronlarda büyüme konisi çökmesinin artması, Aβ agregatlarının toksik etkisini gösterir.
Bu teste en az bir hafta önceden, ticari olarak elde edilen, tam uzunlukta A-beta-42'nin taze bir şişesini açarak ve içeriği steril damıtılmış suda 0.5 milimolar konsantrasyona kadar çözerek başlayın. Agregasyon ve toksisiteyi indüklemek için yedi gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Toplanmış A-beta-42'nin alikotlarını hazırlayın ve kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Nöronal kültürün dördüncü gününde, kuyucukları daha önce gösterildiği gibi bir saat boyunca orta B'de 100 mikrolitre 0.5 mikromolar agrega A-beta-42 veya araç çözeltisi ile tedavi edin. Bir saat geçtikten sonra, kültür ortamını çıkarın ve nöronları hemen PBS'de% 4 sakaroz içeren% 4 paraformaldehit ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca sıcak bir plaka üzerinde sabitleyin.
Büyüme konilerinin şeklini korumak bu protokol için kritik öneme sahip olduğundan, fiksasyon çoğunlukla önemlidir.
Fiksasyondan sonra, nöronları PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, odayı çıkardıktan sonra, nöronları sulu bir montaj ortamı ile monte edin. Montaj ortamını iki ila dört gün boyunca 4 santigrat derecede kurutun. Ters çevrilmiş bir mikroskopta 20x kuru objektif lensi ile her kuyucuğun tüm alanını yakalayın.
Her kuyudaki tüm alanı yakalamak ve analiz etmek, öznellikten kaçınmak için önemlidir.
Aşama 3 veya 4'teki her nöronun en uzun nöritlerini aksonlar olarak sınıflandırın. Lamelipodia içermeyen veya üçten az filopodia'ya sahip olan aksonal büyüme konileri, çökmüş büyüme konileri olarak kabul edilir.