İnsan Kortikal Beyin Dilimlerinde Amiloid-Beta Peptitlerin Görselleştirilmesi

Bir Alzheimer hastasından toplanan kortikal bir beyin dokusu dilimi içeren bir cam slayt alın. Doku, parankim ve serebral kılcal damarlar içinde çözünmeyen amiloid-beta birikintileri içerir.

Lipitleri ve tuzları çıkarmak için slaydı seyreltilmiş alkole batırın.

Dokuyu kurutmak için mutlak alkolle yıkayın, ardından doku mimarisini korumak için bir fiksatif uygulayın.

Nemi gidererek slaytı vakumla kurutun.

Amiloid-beta agregatlarını daha küçük çözünür peptitlere parçalamak için nemlendirilmiş bir ortamda formik asit buharı ile muamele edin.

Optik bir tarayıcı kullanarak, görüntüleme kütle spektrometresinden elde edilen verileri yorumlamak için dokunun yapısal özelliklerinin görüntülerini oluşturun.

Numunenin üzerine bir matris çözeltisi püskürtün.

Bir kütle spektrometresi kullanarak, peptitleri iyonize etmek için matrisin emdiği bir lazer uygulayın. Bir dedektör daha sonra bunları kütle-yük oranlarına göre tanımlar.

Doku parankimi ve serebral kılcal damarlardaki amiloid-beta peptitlerinin dağılımını ortaya çıkaran görüntüler üretmek için verileri analiz edin.

Doku bölümlerini durulamak için, endojen lipitleri ve inorganik tuzları çıkarmak için numuneleri 40 ila 100 mililitre% 70 etanole 30 saniye boyunca bir cam boyama kavanozuna daldırın. Numuneleri metin protokolünde listelenen yıkama sırasını kullanarak yıkayın. Ardından numuneleri 30 dakika vakumda kurutun.

Şimdi, otopsi beyin dokusundan amiloid-beta proteinlerinin daha iyi iyonlaşması için doku bölümlerini bir formik asit buharı ile tedavi edin. Bunu yapmak için fırını 60 derecede ve 5 mililitre% 100 formik asit içeren bir inkübasyon cam kabı hazırlayın. İnkübasyon cam kabındaki hava nemini doygunluk seviyesinde tutun.

Formik aside daldırılmasını önleyerek doku slaytlarını inkübasyon cam kabına yerleştirin ve altı dakika tedavi edin. Bir film tarayıcı, jel tarayıcı veya dijital mikroskop kullanarak numunelerin optik görüntüsünü alın. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin.

Numunelerin optik görüntüsünün hizalanması, numune hedefi cihazın içine yerleştirildiğinde gereklidir. Genellikle, matris tabakasının altındaki doku bölümünü tanımak mümkün olmayacaktır. Optik görüntüleri örneklerle ilişkilendirmek için, hem optik görüntüde hem de kamera optiğindeki matris katmanının altında görünen kılavuz işaretleri yapın. En kolay yol, optik görüntüyü çekmeden önce numunenin etrafında en az üç düzeltme sıvısı işareti tespit etmektir.

Matrisi ultrasonik bir püskürtücü ile püskürtmek için, püskürtülecek dokuyu desikatörden çıkarın ve hazneye yerleştirin. Dokunun sensör penceresini kapatmadığından emin olun. Başlat düğmesine basarak hazırlığa başlayın. Genellikle hazırlık süresi 90 dakika civarındadır.

Hazırlık, matris tabakası kalınlığının ve ıslaklığının izlenmesi yoluyla otomatik olarak düzenlenecektir. Alternatif olarak, matris çözeltisini otomatik bir püskürtücü ile doku yüzeyine püskürtmek için, matris çözeltisini iletmek için dakikada 10 PSI ve 0,15 mililitreye ayarlanmış bir çözücü pompa sistemi kullanın.

Sabit bir ısıtılmış kılıf gazı akışı, matris çözeltisi spreyi ile birlikte verilecektir. MALDI-IMS ile yüksek verimli ve yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme deneyleri gerçekleştirin. Kütle spektrometresi ölçümleri için, MALDI kontrol yazılımını ve veri analiz yazılımını kullanarak doku alanlarını tanımlayın.

2.000 ila 20.000 kütle-yük oranı aralığı ve 20 ila 100 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip pozitif doğrusal modda spektrumlar elde edin. Kalibrasyon standardını yapmak için, protein kalibrasyon standardındaki peptit kalibrasyon standardını TA30 çözeltisinde CHCA ile 1'e 4 oranında çözün ve ardından 10 kez seyreltin.

1 mikrolitre kalibrasyon standardını slayta dört farklı yere yerleştirin. Moleküler histoloji yazılımını kullanarak, arteriyel duvarlardaki yaşlılık plaklarında birlikte lokalize olan farklı amiloid-beta peptitleri gibi çeşitli sinyallerin uzamsal korelasyonunu bulmak için çoklu sinyal görüntülerini üst üste bindirin.