JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:06 dk. • July 8th, 2025
Serebral mikrokanamalar veya CMH'ler, kan-beyin bariyerinin bozulmasının neden olduğu nöroinflamatuar beyin kanamalarıdır ve kırmızı kan hücrelerinin veya eritrositlerin beyin dokusuna sızmasına neden olur.
CMH'leri tespit etmek için, CMH'li bir sıçandan alınan sabit beyin dokusu ile başlayın.
Kriyoproteksiyon için dokuyu sakarozun içine daldırın.
Bir kriyo-mikrotom kullanarak, dokuyu bölümlere ayırın ve bir bölümü bir cam slayt üzerine toplayın.
Kalan fiksatifi çıkarmak için yıkayın.
Negatif yüklü DNA ile etkileşime giren ve çekirdeği kırmızımsı-mor boyayan bir metal katyona bağlı hematoksilen boyası uygulayın.
Fazla boyayı çıkarmak için asit-alkol ile devam edin, ardından asidik ortamı nötralize etmek ve boyayı mavi formuna dönüştürerek kontrastı artırmak için alkali bir mavileştirme maddesi uygulayın.
Leke penetrasyonunu iyileştirmek için dokuyu alkolle yıkayın, ardından eritrositleri kırmızı-turuncu ve doku bileşenlerini pembeye boyamak için eozin uygulayın.
Artan alkol konsantrasyonları kullanarak dokuyu kurutun ve mikroskobik görselleştirme için ksilen ile temizleyin.
CMH'leri doğrulayan kırmızı-turuncu renkli sızan RBC'leri tespit etmek için görüntüler yakalayın.
Beyni izole ettikten sonra, en az altı saat boyunca veya beyin tüpün dibine batana kadar PBS'de% 20 sükroz içine daldırın. Çözeltiyi% 30 sükroz olarak değiştirin ve altı saat daha sabitleyin.
Son olarak, bir kriyostat kullanarak 10 milimetre kalınlığında beyin dokusu bölümleri hazırlayın. Slaytları damıtılmış suda yıkayarak H & E boyamaya başlayın. Ardından, sekiz dakika boyunca hematoksilen çözeltisine daldırın. Boyamayı takiben, akan musluk suyunda beş dakika yıkayın. 30 saniye boyunca% 1 asit-alkolde farklılaştırın.
Akan musluk suyunda bir dakika yıkadıktan sonra,% 0.2 amonyaklı su veya doymuş lityum karbonat çözeltisinde 30 saniye ila bir dakika arasında lekeleyin. Ardından, beş dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın. 30 saniye ila bir dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin. % 90 alkol, ardından% 95 alkol ve mutlak alkol ile her biri 0,5 ila 2 dakika kurutun.
Dehidrasyondan sonra, 30 saniye boyunca ksilen içinde temizleyin. Montajdan sonra, parlak alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak H&E boyamasını analiz edin. CMH'lerin bileşenleri olan kan damarlarından salınan kırmızı kan hücreleri, H&E boyaması altında kırmızı-turuncu renkte görünür.