Geri Dönüştürülmüş Sinaptik Veziküllerin Optik Analizi için Kültürlenmiş Nöronların Hazırlanması

Floresan etiketli sinaptophysin ve sinaptotagmin-1 dahil olmak üzere sinaptik vezikül zarı proteinlerini eksprese eden kültürlenmiş nöronları içeren bir lamel ile başlayın.

Ortamı çıkarın, depolarizasyon tamponu ve birincil antikorların bir karışımını ekleyin, ardından inkübe edin.

Tampon iyonları hücrelere girer ve sinaptik veziküllerin zar ile füzyonunu uyarır ve bu da sinaptotagmin-1'i açığa çıkarır.

Birincil antikorlar, maruz kalan sinaptotagmin-1'e seçici olarak bağlanır.

Tamponu atın ve bağlanmamış antikorları çıkarmak için ortamla yıkayın.

Membran içselleştirmesini kolaylaştırmak için taze ortam ekleyin ve inkübe edin, etiketli sinaptofizin ve antikora bağlı sinaptotagmin-1 ile geri dönüştürülmüş veziküller oluşturun.

Ortamı çıkarın, hücreleri sabitleyin ve yıkayın.

Floroforla bağlanmış ikincil antikorlara sahip deterjan bazlı bir bloke edici tampon ekleyin.

Deterjan hücrelere nüfuz ederek ikincil antikorların antikora bağlı sinaptotagmin-1 ile etkileşime girmesine izin verir.

Lameli kaldırın, suyla yıkayın ve kurulayın.

Lameli yüzü aşağı bakacak şekilde, çift etiketli geri dönüştürülmüş veziküllerin optik analizi için gömme ortamı olan bir slayt üzerine yerleştirin.

600 mikrolitre 1x depolarizasyon tamponu ve 10 mililitre hücre kültürü ortamını su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. 1x depolarizasyon tamponuna 1 mikrolitre fare anti-SYT1 antikoru ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Hücre kültürü ortamını hücrelerden çıkardıktan ve attıktan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre depolarizasyon antikor karışımı ekleyin.

Plakayı inkübatörde 37 santigrat derecede ve% 5 CO_2'de 5 dakika inkübe edin. Depolarizasyon antikorunu çıkarın ve atın, karıştırın ve hücreleri hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 1 mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.

Ardından, 750 mikrolitre orta maddesini çıkarın ve aynı miktarda taze orta malzemesi ekleyin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. Ardından, hücre kültürü ortamını çıkarın ve atın ve 1x PBS'ye 300 mikrolitre %4 PFA ekleyin.

Son olarak, her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkamadan önce 4 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İkincil floroforla birleştirilmiş antikoru, 1 ila 1.000'lik bir seyreltmede her kuyucuk için 200 mikrolitre bloke edici tampon içinde seyreltin. Kültürlenmiş nöronlarla birlikte lamelleri içeren her kuyucuktan 1x PBS'yi çıkarın ve atın.

Her oyuğa 200 mikrolitre bloke edici tampon antikor karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri 1 mililitre 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ardından, mikroskop lamına 7 mikrolitrelik bir damla gömme ortamı ekleyin. Lameli 24 oyuklu plakadan bir kanül ile kaldırarak ve forseps ile tutarak çıkarın. PBS'yi çıkarmak için lameli damıtılmış suya batırın ve bir kenarını yumuşak bir dokuya dokundurarak dikkatlice kurulayın.

Lameli gömme ortam damlacığının üzerine çevirin, böylece hücreleri taşıyan yüzey mikroskop slaytına bakar, böylece hücreleri gömme ortamına gömer. Slaytları kaputun altında bir ila iki saat kurumaya bırakın ve ışığa maruz kalmamak için üzerlerini örtün. Kurutulmuş slaytları 4 santigrat derecede bir mikroskop slayt kutusunda saklayın.