JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:25 dk • July 8th, 2025
Yanlış katlanmış bir proteinin kümeleri olan alfa-sinüklein veya alfa-S agregatları ile muamele edilmiş yapışık bir nöron kültürü ile başlayın.
Bu kümeler, hücre içi inklüzyonlar oluşturmak üzere toplanır.
Hücresel bütünlüğü korumak için ortamı bir sabitleme solüsyonu ile değiştirin.
Sabitleme solüsyonunu çıkarın ve tamponla yıkayın.
Ardından, hücresel zarı geçirgen hale getirmek için bir yüzey aktif madde ekleyin.
Yüzey aktif maddeyi çıkarın ve tampon ile yıkayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici çözelti tanıtın.
Şimdi, spesifik olarak alfa-S inklüzyonlara ve yapısal proteinlere bağlanan birincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Floresan etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın.
Çekirdeği etiketlemek için bir floresan lekesi ekleyin.
Lekeyi çıkarın ve tampon ile yıkayın.
Montaj ortamını kullanarak, lameli nöronlarla birlikte bir kızağa monte edin.
Floresan mikroskobu altında, nöron içindeki immün etiketli alfa-S inklüzyonları gözlemleyin.
Kimyasal bir davlumbazda immünofloresan yapmak için, nöronları PBS'de %2 paraformaldehit ve %5 sükroz çözeltisi ile oda sıcaklığında 15 dakika çalkalamadan sabitleyin. 15 dakika sonra, sabitleme solüsyonunu çıkarın ve nöronları PBS ile üç kez kısaca yıkayın.
Daha sonra, nöronları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS'de% 0.3 noniyonik yüzey aktif madde ile geçirgenleştirin. Ardından, nöronları PBS ile üç kez kısaca yıkayın. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için nöronları PBS'de% 3 FBS ile oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, nöronları bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca soğuk odada veya buzdolabında gece boyunca 4 santigrat derecede PBS'de% 3 FBS'de çözünmüş uygun birincil antikor ile inkübe edin.
Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri üç kez PBS ile kısa bir süre yıkayın. Daha sonra, nöronları PBS'de% 3 FBS'de çözünmüş uygun floresan ikincil antikor ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
Antikor solüsyonunu çıkarın ve PBS ile üç kez kısa bir süre yıkayın. Daha sonra, nöronları bir orbital çalkalayıcı üzerinde karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca DAPI çözeltisi ile boyayın. 15 dakika sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve PBS ile üç kez kısa bir süre yıkayın. Lamellerin solmasını önleyici montaj ortamı kullanarak lamel üzerine monte edin.