JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:33 dk • July 8th, 2025
Silikon bir membrana tutturulmuş çok kuyulu dipsiz bir plaka ile başlayın. Membran, hücre yapışmasını kolaylaştırmak için bir biyopolimer ile kaplanmıştır.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronları veya hiPSCN'leri, bir ortamda kuyucuklara süspanse edin. Ortam, hücre yapışmasını arttırmak için hücre dışı matris veya ECM proteinleri ile desteklenir.
Plakayı inkübe edin, hücrelerin ECM proteinlerine ve biyopolimere yapışmasına izin verin ve zar yüzeyi ile düzgün etkileşimi teşvik edin.
Ardından, plakayı bir yaralanma cihazının aşamasına sabitleyin.
Cihazı kullanarak, nöronlar üzerinde kontrollü mekanik stres oluşturmak için zar üzerine girinti uygulayın.
Stres, hücre iskeletini bozar, bu da nörit adı verilen hücresel çıkıntıların dejenerasyonuna ve nöritler boyunca küçük şişliklerin oluşmasına neden olur.
Stres ayrıca hücre zarı bütünlüğüne zarar vererek hücre ölümüne neden olur.
Gerilme yaralanması fenotipi sergileyen hiPSCN'ler artık analiz için hazırdır.
Plakayı uzatmak için, "Konum İzleme" sanal enstrümanındaki "Dosya adı" ve "Dosya yolu" alanını benzersiz bir dosya adıyla değiştirin ve Çalıştır okuna tıklayın. Hareket kontrol paneli sanal enstrümanındaki "Yaralanma" ve "Yaralanma süresi" alanlarında girintinin derinliğini ve süresini ayarlayın. Plaka sıfır konumundayken, "Hareket Kontrol Paneli" sanal enstrümanını çalıştırın ve plakayı girintilemek için Yarala'ya tıklayın.
Sahneyi yukarı taşımak için Üst'e tıklayın, plaka en üst konumdayken Durdur'a tıklayın ve yaralanma cihazını devre dışı bırakmak için kapıyı açın. Ardından, belirtilen maksimum yer değiştirmenin uygulandığını doğrulamak için "Position Tracker" sanal aracında sunulan aşamanın yer değiştirme geçmişini inceleyin ve verileri uygun bir elektronik tablo programına aktarın.
Plazma işleminden sonra silikon zarın gerilmesini değerlendirmek için, plakayı yumuşak bir yüzeye yerleştirin ve küçük çıkıntıyı kalıcı bir keçeli kalemden gelen mürekkeple bir damga üzerine astarlayın. Damgayı test edilecek ilk kuyucuğa yerleştirin ve iyi bir mürekkep aktarımı sağlamak için hafifçe vurun. Tüm kuyular damgalandığında, görüş alanı 3'e 4'lük bir ızgarada 12 girinti içerecek şekilde lens en küçük numaralı F-stop'a ayarlanmış olacak şekilde, yaralanma cihazının üzerindeki bir bom standına yüksek hızlı bir kamera yerleştirin.
Plaka sıfır noktası konumundayken, kamera yazılımındaki Kayıt düğmesine "Tetik Girişi" yazacak şekilde bir kez tıklayın ve parlak, dağınık eksenel ışığı açın, ardından plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin ve eksenel ışığı kapatın.
Bir hücre kültürüne zarar vermek için, plazma ile muamele edilmiş plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre laminin ile muamele edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöronlar ekleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka tabanına yapışmasına izin verin, plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirmeden önce. 2 ila 3 günlük kültürden sonra, plakayı yaralanma cihazı aşamasına sıkıştırın ve kültürleri ortam havasına maruz bırakmadan plakayı sabitlemek için kapağın konumunu ayarlayın. Ardından, plaka sıfır noktası konumundayken, plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin.