JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:30 dk. • July 8th, 2025
Transfekte edilmiş memeli hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Bu hücreler, koku alma nöronunun koku alma reseptörünü (OR), bir G-proteinine bağlı reseptörü ve bir mutant lusiferaza kaynaşmış bir cAMP bağlanma alanı içeren bir cAMP biyosensörünü eksprese eder.
Ortamı çıkarın ve kalan ortamı çıkarmak için tamponla yıkayın.
Bir cAMP biyosensör substratı içeren bir tampon ekleyin. Hücrelere substrat alımını kolaylaştırmak için inkübe edin.
Bir kemilüminesans plaka okuyucusu kullanarak, hücrelerin bazal lüminesansını ölçün.
Kuyucuklara artan konsantrasyonlarda test koku verici ekleyin ve bir tanesini kontrol olarak işlenmemiş halde bırakın.
Koku verici ameliyathaneye bağlanır ve cAMP üreten bir sinyal kaskadını tetikler.
Bu cAMP, biyosensörün bağlanma alanına bağlanarak ışık yaymak için substrat ile etkileşime giren lusiferazı aktive eder.
Lüminesansı gerçek zamanlı olarak ölçün. Daha yüksek koku verici konsantrasyonları ile lüminesansta bir artış, koku verici tarafından VEYA aktivasyonunu gösterir.
Stimülasyondan önce, inkübatöre geri dönmeden önce kuyu başına% 50 ila% 80 arasında uygun bir birleşme sağlamak için transfekte edilmiş hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin