JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:30 dk • July 8th, 2025
Transfekte edilmiş memeli hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Bu hücreler, koku alma nöronunun koku alma reseptörünü (OR), bir G-proteinine bağlı reseptörü ve bir mutant lusiferaza kaynaşmış bir cAMP bağlanma alanı içeren bir cAMP biyosensörünü eksprese eder.
Ortamı çıkarın ve kalan ortamı çıkarmak için tamponla yıkayın.
Bir cAMP biyosensör substratı içeren bir tampon ekleyin. Hücrelere substrat alımını kolaylaştırmak için inkübe edin.
Bir kemilüminesans plaka okuyucusu kullanarak, hücrelerin bazal lüminesansını ölçün.
Kuyucuklara artan konsantrasyonlarda test koku verici ekleyin ve bir tanesini kontrol olarak işlenmemiş halde bırakın.
Koku verici ameliyathaneye bağlanır ve cAMP üreten bir sinyal kaskadını tetikler.
Bu cAMP, biyosensörün bağlanma alanına bağlanarak ışık yaymak için substrat ile etkileşime giren lusiferazı aktive eder.
Lüminesansı gerçek zamanlı olarak ölçün. Daha yüksek koku verici konsantrasyonları ile lüminesansta bir artış, koku verici tarafından VEYA aktivasyonunu gösterir.
Stimülasyondan önce, inkübatöre geri dönmeden önce kuyu başına% 50 ila% 80 arasında uygun bir birleşme sağlamak için transfekte edilmiş hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Ardından, Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine 10 milimolar HEPES ve 5 milimolar glikoz ekleyerek stimülasyon ortamı hazırlayın. Gerçek zamanlı döngüsel AMP tahlili substrat reaktif alikotlarının 55 mikrolitrelik alikotlarını buz üzerinde çözün.
55 mikrolitre substrat reaktifi ve 2.750 mikrolitre stimülasyon ortamını karıştırarak% 2 dengeleme çözeltisi hazırlayın. Tezgahın üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası yaydıktan sonra, transfeksiyon ortamının kağıt havlular tarafından emilmesi için plakayı kağıt havluların üzerine baş aşağı hafifçe ve tekrar tekrar vurun. Her bir oyuğa 50 mikrolitre stimülasyon ortamı pipetleyerek hücreleri yıkayın.
96 oyuklu plakadan stimülasyon ortamını nazikçe ve tekrar tekrar dışarı vurun. Her bir kuyucuğa 25 mikrolitre% 2 dengeleme çözeltisi pipetleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. İnkübasyon süresinin bitiminden önce, çözülmüş kokulu stok çözeltilerini stimülasyon ortamındaki çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
Koku ilavesinden önce, plakanın bazal lüminesans seviyesini ölçmek için bir kemilüminesans plaka okuyucusu kullanın. Plakayı plaka okuyucudan hızlı bir şekilde çıkarın ve her bir oyuğa 25 mikrolitre koku seyrelticisi ekleyin. Ardından, 30 dakika içinde 20 döngü boyunca tüm kuyucukların sürekli lüminesans ölçümünü hemen başlatın.