Retinoik Asit Raportör Hücre Hattı Kullanılarak Nörosferlerde Retinoik Asit Seviyelerinin Ölçülmesi

Retinoik asit (RA) raportör hücrelerinin yapışık bir kültürünü alın.

Bu hücreler, retinoik asit yanıt elemanı (NARE) tarafından düzenlenen β-galaktosidazı kodlayan lacZ genini içeren transgenik bir yapı taşır.

Fare omurilik kök hücre nörosferlerinden türetilen tohum ayrışmış hücreler. Kuluçkaya yatmak.

Nörosfer hücreleri, raportör hücrelere giren ve RARE'deki reseptör kompleksine bağlanan RA'yı serbest bırakır.

Bu, β-galaktosidaz ekspresyonunu başlatan bir transkripsiyonel aktivatör kompleksi oluşumunu tetikler.

Hücresel morfolojiyi korumak için ortamı bir fiksatif ile değiştirin.

Sabitleyiciyi çıkarın ve bir tamponla yıkayın.

Hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir geçirgenlik tamponu ekleyin.

Bir β-galaktosidaz substratı ekleyin ve inkübe edin.

Substrat, raportör hücrelere girer, burada β-galaktosidaz onu oksitlenen ve dimerleşen kararsız bir ürüne hidrolize ederek mavi renkli bir çökelti oluşturur.

Bir tampon ile yıkayın.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, absorbansı ölçün ve nörosfer hücrelerinden RA sekresyonunu ölçmek için standart bir eğri ile karşılaştırın.

Nörosfer ko-kültürleri için, bir nörosfer kültürünün 15 mililitrelik tüplere aktarılmasıyla başlayın. Tüpleri