JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:58 dk • July 8th, 2025
İstenilen gelişim aşamasında sabit, transgenik bir embriyonik fare gastrointestinal sistemi alın.
Gastrointestinal sistemin enterik sinir sistemi, kolin asetiltransferaz eksprese eden enterik nöronları ve kolinerjik nöronları içerir.
Bu kolinerjik nöronlar ayrıca kolin asetiltransferaz promotörü tarafından yönlendirilen bir floresan proteini eksprese eder.
Hücrelere nüfuz etmek ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için yolu iyonik olmayan bir deterjan ve proteinlerle inkübe edin.
Birincil antikorlarla değiştirin. Antikorların sırasıyla nöronlardaki hedef proteinlerini bağlaması için inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın ve tampon ile yıkayın.
Hedef proteinlere bağlı birincil antikorları spesifik olarak bağlamak için florofor konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.
Fazla antikorları çıkarın ve tampon ile yıkayın.
Etiketli kanalı, çekirdekleri lekelemek için nükleer bir boya içeren montaj ortamına daldırın. Şimdi, bir lamel monte edin.
Konfokal mikroskopi kullanarak, gastrointestinal sistemdeki kolinerjik nöronların dağılımını görselleştirin ve analiz edin.
GI kanallarını, 1x PBS,% 3 sığır serum albümini, 0.1 Triton X-100 ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kayadan oluşan bloke edici çözelti içeren 0.2 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Bloklamadan sonra, blokaj solüsyonunu ince uçlu bir Pasteur pipeti ile aspire edin ve blokaj solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorların optimal seyreltilmesi ile değiştirin.
Odasıcaklığında dört saat veya sallanan platformda gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonunu takiben, antikor çözeltisini aspire edin ve GI yollarını PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez ve daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca sallayarak durulayın.
Son yıkamadan sonra, PBS'yi bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş florofor konjuge ikincil antikorlarla değiştirin ve tüpleri karanlıkta dört saat boyunca oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 santigrat derecede sallanan platforma yerleştirin.
GI kanallarını daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, DAPI ile birkaç damla floresan montaj ortamını bir cam slayt üzerine yerleştirin, ardından GI kanalını montaj ortamına daldırın ve bir kapak camı ekleyin. Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanarak her bir floroforun görüntülerini yakalayın, ardından uygun yazılımı kullanarak bilgisayar destekli görüntü analizi yapın.
Bu makale, transgenik embriyonik farelerin enterik sinir sistemindeki kolinerjik nöronların görselleştirilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Teknik, bu nöronların gastrointestinal sistemdeki dağılımını analiz etmek için immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi kullanımını içermektedir.
Embriyonik fare gastrointestinal sistemindeki nöronal popülasyonların immünofloresan boyanması, gelişim sırasındaki enterik nöron alt tiplerinin hassas bir şekilde görselleştirilmesine ve kantifikasyonuna olanak tanır. Bu yetenek, erken aşama keşif ekiplerinin nöronal hedefleri doğrulamasına ve gastrointestinal bozukluklarla ilgili gelişimsel yolları anlamasına destek olur. Yöntem, hastalık modellemedeki öngörü güvenini artırır ve nörogastroenteroloji programları için risk ayarlı portföy kararlarına bilgi sağlar.
Bu immünofloresan iş akışı, erken keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olarak, enterik nörobilimdeki hem hedef doğrulama hem de translasyonel araştırmaları desteklemektedir.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026