Nörodejeneratif Hastalık Modellemesi için Sıçan Substantia Nigra'ya Viral Vektör Enjeksiyonu

Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaktik bir çerçeveye sabitleyin.

Kafa derisini dezenfekte edin ve kafatasını ortaya çıkarmak için kraniyal orta hat kesisi yapın.

Enjeksiyon bölgesini belirlemek için kafatasındaki iki referans noktası olan bregma ve lambda'yı tanımlayın.

Viral vektör süspansiyonu içeren bir mikroenjeksiyon şırıngası hazırlayın.

Viral vektör, nörodejeneratif hastalıklarda substantia nigra'nın nöronlarında yanlış katlanma ve agregasyona uğrayan bir protein olan alfa-sinükleini kodlayan bir transgen taşır.

Şırıngayı bir mikroenjeksiyon pompasına bağlı stereotaksik alete yerleştirin.

Beyin hasarını önlemek için enjeksiyon bölgesinde bir çapak deliği oluşturun.

Duraya bir iğne ile nüfuz edin ve herhangi bir kanı steril doku ile temizleyin.

Substantia nigra'ya ulaşmak için mikroenjeksiyon iğnesini çapak deliğinden geçirin.

Viral süspansiyonu yavaşça enjekte ederek eşit dağılımı sağlayın.

Geri akışı önlemek için kısa bir süre duraklayın, ardından iğneyi yavaşça geri çekin.

İnsizyonu dikin.

Model artık daha fazla analiz için hazırdır.

Sekiz haftalık bir dişi Wistar sıçanını onaylanmış protokollere göre uygun şekilde anestezi uygulayarak başlayın. Her bir pençeyi sıkarak ve geri çekilme refleksinin olmadığını belirterek cerrahi bir anestezi planına ulaşılıp ulaşılmadığını kontrol edin. Daha sonra, farenin arkasına bir mikrotransponder yerleştirmek için bir mikrotransponder implanter kullanın. Mikrotransponderin doğru yerleştirildiğini ve bir okuma elde edilip edilemeyeceğini kontrol edin.

Şimdi farenin kafa derisindeki saçları kesin ve kafa derisine ve kulaklara lokal anestezik uygulayın. Sıçanı laminer bir akış başlığına aktarın ve prosedürün geri kalanını aseptik teknik kullanarak gerçekleştirin. Kulak çubuklarını, ardından ağız ve burun çubuğunu sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Vücut ısısında bir düşüş olmasını önlemek için farenin vücudunu bir kağıt örtü ile örtün. Gözlerin kurumasını önlemek için oküler bir kayganlaştırıcı uygulayın.

Ardından, kafa derisini onaylanmış prosedürlere göre dezenfekte edin. Burada %70 izopropanol içinde %1 iyot kullanılmaktadır. Kafa derisinin orta hattında küçük bir kesi yaptıktan sonra, kafatasındaki zarları nazikçe kazıyın ve tuzlu su ile durulayın. Kafatasının kurumasına izin verdikten sonra, bregma ve lambda'nın net bir şekilde görülebildiğinden emin olun.

Şimdi, 10 mikrolitrelik, 30 gauge 20 milimetrelik bir mikroenjeksiyon şırıngasını rekombinant AAV ile doldurun ve stereotaksik alete bağlı motorlu mikroenjeksiyon pompasına yerleştirin.

Substantia nigra'nın dopaminerjik nöronlarının spesifik transdüksiyonu için, rekombinant AAV vektörleri, yüksek titreleri ve dopaminerjik nöronları dönüştürme etkinlikleri nedeniyle ilk tercihtir.

Bir damla AAV bırakarak akışı test edin. Açığa çıkan herhangi bir AAV'yi çok değerlikli bir temizlik deterjanı içinde atın. Kafanın düz bir şekilde kafa çerçevesine sabitlendiğini görsel olarak kontrol edin. Daha sonra önce iğnenin ucunu bregmaya doğru hareket ettirerek ve iğnenin ucunu kafatasına değene kadar dorsoventral yönde indirerek bu noktadaki yüksekliği ölçerek kafatasının düz olup olmadığını kontrol edin. İşlemi lambda'da tekrarlayın.

İğneyi bregmaya geri döndürdükten sonra, iğneyi anteroposterior ve mediolateral yönde mikroenjeksiyon için stereotaksik koordinatlara hareket ettirin. Koordinatları not edin. Enjeksiyon bölgesinde, kafatasının yüksekliğini daha önce olduğu gibi ölçün ve bregma yüksekliğinden 0,3 milimetreden daha farklı olmadığından emin olun.

Ardından kafatasına dikkatlice 2 milimetrelik bir delik açın. Delik açıldıktan sonra, dorsoventral koordinatın uygulanacağı referansı belirlemek için duranın yüksekliğini ölçün. 26 gauge iğne kullanarak duraya nüfuz edin. Herhangi bir kanı steril bir doku ile emdirin ve sadece tüm kanama durduktan sonra devam edin.

Şimdi önceden yüklenmiş mikroenjeksiyon şırıngasının iğnesini beyne dorsal ventral koordinata yavaşça indirin ve bir dakika bekleyin. Daha sonra dakikada 0.25 mikrolitre oranında üç mikrolitre AAV enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, yavaşça çıkarmadan önce iğne yolu boyunca geri akışı önlemek için iğnenin beş dakika daha yerinde kalmasına izin verin.

Kaplanmış örgülü polyester 3.0 kullanarak kafa derisini dikin ve burun ve ağız çubuğunu gevşetmek için cildi %70 izopropanol içinde %1 iyot ile dezenfekte edin ve ardından hayvanı stereotaktik aletten nazikçe çıkarmak için iki kulak çubuğunu dezenfekte edin. Bu sırada, analjezi ve gerekirse bir anestezi tersine çevirme ajanı uygulayın. Ardından, fareyi 38 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafese koyun ve uyanana kadar yakından izleyin.