İnsan Postmortem Beyin Dokusundan Deterjanda Çözünmeyen Protein Agregatlarının İzolasyonu

Doğrulanmış bir nörodejeneratif hastalık vakasından donmuş bir ölüm sonrası insan beyni dokusu örneği ile başlayın.

Çözünmeyen protein agregatları açısından zengin gri maddeyi tüketin, hastalığın ayırt edici özelliği.

Dokuyu bir homojenizatöre aktarın.

İnhibitörler içeren bir tampon ekleyin ve hücre içi bileşenleri serbest bırakmak için homojenize edin.

İnhibitörler proteaz ve fosfataz enzimlerini bloke ederek protein bozulmasını önler.

Homojenatı bir tüpe aktarın ve iyonik bir deterjan tamponu ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Deterjan, doğal olarak katlanmış proteinleri çözerken, yanlış katlanmış protein agregatları bozulmadan kalır.

Hücresel ayrışmayı tamamlamak için sonikat.

Homojenatı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve yüksek hızda santrifüjleyin.

Agregalar dibe çöker.

Deterjanda çözünür proteinler içeren süpernatanı çıkarın.

Agregaları iyonik bir deterjan tamponu, santrifüj ile yıkayın ve süpernatanı çıkarın.

Protein agregatlarını denatüre etmek ve onları çözünür hale getirmek için üre tamponu ekleyin.

Çözündürülmüş protein agregatlarını bir tüpe aktarın ve tam çözünmeyi sağlamak için kısaca sonikat yapın.

Sağlıklı kontrolden donmuş postmortem beyin dokusu elde edin ve patolojik olarak doğrulanmış AD. Her doku örneğinden yaklaşık 250 miligram gri madde çıkarmak için forseps ve tıraş bıçağı kullanın. Beyin segmentinin bir dakika çözülmesine izin verin. Şimdi, bir doku parçasını çözülürken kabaca iki milimetre küp küp parçalar halinde doğrayın. Buz üzerinde iki mililitrelik önceden soğutulmuş dounce homojenizatör tüpüne aktarın.

Beyaz maddeden ve büyük kan damarlarından kaçınmayı unutmayın.

Hızlı çalışın ve dokuyu yırtılabilir tek kullanımlık tartı botlarına yerleştirin. Beyin dokusunun bulunduğu tartı teknesini sık sık kuru buzlu polistiren kaplara yerleştirerek dokunun çözülmesini önlemeye özen gösterin. Gerekli tüm doku parçalarını inceledikten ve tarttıktan sonra, kuru buzdan bir parça doku içeren bir tartı teknesini çıkarın.

Daha sonra, bir gram doku başına proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile beş mililitre buz gibi düşük tuzlu tampon ekleyin ve yaklaşık 10 vuruş yüksek boşluklu havaneli A ve 15 vuruş düşük boşluklu havaneli B kullanarak buz üzerinde homojenize edin. Ardından, her bir homojenatı etiketli iki mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarmak için dokuz inçlik bir cam Pasteur pipeti kullanın. Kalan homojenatı, -80 santigrat derecede saklamak için benzer şekilde ek etiketli 1,5 mililitrelik tüplere ayırın.

Fraksiyonlamaya devam etmek için, her 0.8 milimetrelik alikota 100 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 100 mikrolitre% 10 Sarkosyl ekleyin. Ters çevirerek iyice karıştırın ve ardından 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından,% 30 genlikte üç adet 5 saniyelik darbe vermek için mikro uçlu bir prob ile donatılmış bir sonikatör kullanın.

Homojenatların protein konsantrasyonlarını belirlemek için bikinkoninik asit yöntemini kullandıktan sonra, her numuneye milimetre başına 10 miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren buz gibi soğuk sark tamponu ekleyin. Ardından, her numunenin 500 mikrolitresini 500 mikrolitrelik polikarbonat ultrasantrifüj tüplerine aktarın.

Tüpleri önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin ve 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 180.000 kez g'de ultrasantrifüj edin. Santrifüjlemeyi takiben, S1 sarkosil çözünür süpernatantları 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve -80 santigrat derecede saklayın. Deterjanda çözünmeyen P1 fraksiyonlarını içeren ultrasantrifüj tüplerine 200 mikrolitre sark tamponu ekleyin ve peletleri ultrasantrifüj tüplerinin altından çıkarmak için pipet ucunu kullanın.

Daha sonra, yeniden askıya alınmış P1 peletlerini yeni 500 mikrolitrelik ultrasantrifüj tüplerine aktarın, teraziyi eşleştirin ve 4 santigrat derecede 30 dakika daha 180.000 kez g'de santrifüjleyin. S2 süpernatantını atın, daha sonra sarkosil çözünmeyen peletlere proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile 50 ila 75 mikrolitre üre tamponu ekleyin ve P2 peletini çözündürmek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, yeniden askıya alınmış P2 peletlerini etiketli 0,5 milimetrelik tüplere aktarın ve% 20 genlikte 1 saniyelik kısa bir mikrotip sonikasyonu kullanarak peletleri tamamen çözündürün. BCA tahlil yöntemini kullanarak sarkosil çözünür ve sarkosil çözünmez fraksiyonlarının protein konsantrasyonlarını belirleyin.