JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:31 dk. • July 8th, 2025
Zebra balığı beyninde nöronlar, metabolizmayı düzenleyen oreksin ve kanabinoid reseptörlerini eksprese eder.
Diyete bağlı obez veya DIO, zebra balığında, bu reseptörler giderek daha fazla heteromerler oluşturmak üzere birlikte lokalize olur, aşağı akış sinyalizasyonunu değiştirir ve metabolik düzenlemeyi etkiler.
Hem kontrolden hem de DIO zebra balığından beyin dokusunun kriyokesitlerini alın. Gömme ortamını çıkarmak için bölümleri tamponla yıkayın.
Hücresel zarları geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için geçirgenliği engelleyen bir tampon ile muamele edin. Fazla tamponu çıkarmak için yıkayın.
Reseptörleri hedef alan bir birincil antikor kokteyli ile inkübe edin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
Birincil antikorlara bağlanan farklı florofor etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
Çekirdeği etiketlemek için floresan DNA bağlayıcı bir boya ekleyin. Ardından, bir montaj ortamı uygulayın ve bölümleri bir lamel ile kapatın.
Konfokal bir mikroskop kullanarak antikor floresansını tespit edin. Kontrollere kıyasla DIO zebra balığındaki antikorların artan ko-lokalizasyonu, daha yüksek reseptör heteromerizasyonunu gösterir.
İlk olarak, bölümleri her biri 0.1 molar fosfat tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın. Primer antikorların karışımını lutesyum PBT'ye ekleyin ve bölümleri gece boyunca oda sıcaklığında nemli bir kutuda inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri her biri 0.1 molar fosfat tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın. PBT içinde seyreltilmiş uygun bir ikincil antikor karışımı içinde bölümleri oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
Bölümleri her biri 0.1 molar fosfat tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın. Nükleer boya DAPI'yi hazırlamak için 1.5 mikrolitre DAPI'yi 3 mililitre fosfat tamponunda çözün. Boyadaki bölümleri karşı boyayın, ardından dokuyu stabilize etmek ve uzun süreli kullanım için lekelemek için slaytları kaplamak için montaj ortamı kullanın. Floresan numuneler karanlıkta 4 santigrat derecede saklanabilir.