JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:47 dk. • July 8th, 2025
Beyin hücrelerini ve sızmış bağışıklık hücrelerini içeren perfüze iskemik fare beyin dokularını alın.
Mendilleri bir süzgeçte kıyın ve tampon ile durulayın.
Süzüntüyü santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Peletleri bir sindirim enzimi çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Sindirim enzimlerinin hücre dışı matrisi parçalaması ve hücreleri gevşetmesi için kuluçkaya yatırın.
Süspansiyonu filtreleyin ve kirletici DNA'yı çıkarmak için DNaz içeren tampon ile durulayın.
Daha sonra DNaz içermeyen tampon ile yıkayın.
Süzüntüyü santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Hücreleri yoğunluk gradyan ortamında yeniden askıya alın. Ardından, içeriği yeni bir tüpe aktarın ve karıştırın. Bileşenleri yoğunluğa göre ayırmak için santrifüjleyin.
Miyelin ve kalıntı içeren süpernatanı çıkarın.
Peleti DNaz içermeyen tamponda yeniden süspanse edin. Yeni bir tüpe aktarın ve tekrar santrifüjleyin.
Yoğunluk gradyan ortamının yeterli şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için süpernatanı atın.
Son olarak, daha fazla analiz için tampondaki hücreleri yeniden askıya alın.
5 mililitrelik bir şırınganın piston ucunu kullanarak, beyin dokusu parçalarını 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve süzgeci kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi HBSS ile sürekli durulayın. Daha sonra homojenize edilmiş dokuları buzun üzerine yerleştirin.
Tüm numuneler işlendiğinde, hücre süspansiyonlarını aşağı doğru döndürün. Ve süpernatanları dikkatlice atın. Peletleri 1 mililitre sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 2 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Ve hücreleri 37 santigrat derecede yavaş sürekli rotasyon altında inkübe edin. Bir saat sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Ve filtreyi DNaz içeren 3 mililitre yıkama tamponu ile iyice durulayın. Ardından süzgeci 15 mililitre DNaz içermeyen yıkama tamponu ile yıkayın. Hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın.
Hücre kalıntılarını ve miyelini çıkarmak için, hücreleri 5 mililitre oda sıcaklığında% 25 yoğunluk gradyan ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri karıştırın ve tekrarlanan nazik pipetleme ile iyice gradyan edin. Sonra hücre çözeltisini aşağı doğru döndürün.
Ayırmanın sonunda, peleti rahatsız etmeden miyelin kaplamasını ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Ve hücreleri 10 mililitre DNaz içermeyen yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve peleti 100 mikrolitre soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek tekrar döndürün.